阿托伐他汀對(duì)缺血再灌注損傷下內(nèi)皮祖細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)以內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)為研究對(duì)象，觀察其在缺血再灌注環(huán)境下的耐受性，并予阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù)，從細(xì)胞水平上探討阿托伐他汀對(duì)缺血再灌注損傷下EPCs的保護(hù)作用及其機(jī)制，試圖為EPCs的移植做初步探討，并為干細(xì)胞的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用密度梯度離心法分離SD大鼠股骨骨髓中單個(gè)核細(xì)胞(MononuclearCells，

2、MNCs)，差速貼壁法純化，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及間接免疫熒光法鑒定EPCs表面標(biāo)志CD133、CD31、CD34、VWF和FLK-1。
　　2.將EPCs隨機(jī)分成對(duì)照組、基質(zhì)組、0.01μmol/l阿托伐他汀組、0.1μmol/l阿托伐他汀組、1μmol/l阿托伐他汀組、10μmol/l阿托伐他汀組、100μmol/l阿托伐他汀組和1 mmol/l阿托伐他汀組等八組。四甲基偶氮唑鹽(MTT)法篩選出阿托伐他汀對(duì)EPCs最佳作用

3、濃度。
　　3.將EPCs隨機(jī)分成對(duì)照組（C組;培養(yǎng)基培養(yǎng)2d）、缺血再灌注組（IR組;第1d培養(yǎng)基培養(yǎng)，第2d加入缺氧緩沖液作用3h后，更換培養(yǎng)基再培養(yǎng)21 h)、阿托伐他汀組（A組;第1d培養(yǎng)基培養(yǎng)，第2d加入最佳作用濃度的阿托伐他汀后再培養(yǎng)1d）、缺血再灌注/阿托伐他汀組（IR/A組;第1d加入缺氧緩沖液作用3h后，更換培養(yǎng)基再培養(yǎng)21 h，第2d加入最佳作用濃度的阿托伐他汀再培養(yǎng)1d）以及阿托伐他汀/缺血再灌注組（A/IR

4、組;第1d加入最佳作用濃度的阿托伐他汀預(yù)處理1d，第2d加入缺氧緩沖液作用3h后，更換培養(yǎng)基再培養(yǎng)21h）。經(jīng)以上各組處理后，行MTT法測(cè)定各組EPCs增殖情況，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、NO及iNOS分泌量，并采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組EPCs凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1.光鏡下觀察可見細(xì)胞形態(tài)的改變。剛提取的MNCs呈圓形，3d開始出現(xiàn)少量梭形細(xì)胞，7d時(shí)大部分細(xì)胞呈梭形，并呈集落樣生長(zhǎng)。14d時(shí)或頭尾相接，呈線索樣或毛細(xì)血管

5、網(wǎng)樣，或呈典型的“鋪路石”形態(tài)。
　　2.間接免疫熒光法檢測(cè)可見EPCs表面生物標(biāo)志CD133、FLK-1、CD31、vWF、CD34等均有表達(dá)。
　　3.在所測(cè)的各個(gè)阿托伐他汀濃度中，10μmol/l和100μmol/l組EPCs增殖率分別為15％和55％，并與對(duì)照組相比有明顯差異(P＜0.05)。而在1mmol/l阿托伐他汀組，EPCs生長(zhǎng)受到抑制。余濃度組與對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.IR組

6、EPCs增殖慢，凋亡細(xì)胞多，NO、iNOS及LDH分泌量增加，并與C組相比有明顯差異(P＜0.05)。而A組EPCs數(shù)量明顯增加，凋亡率、LDH、NO、iNOS分泌量明顯減少，并與C組相比有明顯差異(P＜0.05)。A/IR組LDH、NO、iNOS分泌量及凋亡率較IR組明顯減少，且兩組間有明顯差異(P＜0.05)。NO含量及iNOS活力呈正相關(guān)，r=0.716。
　　結(jié)論:
　　1.采用密度梯度離心法和差速貼壁法分離及純化骨