谷氨酰胺聯(lián)合維生素C對熱應激致大鼠腸源性內毒素血癥的預防作用及機制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 中暑(heat illness)是指在高溫環(huán)境和熱輻射的長時間作用下發(fā)生的一組急性疾病，由于不同個體對高溫耐受的差異，出現(xiàn)體溫調節(jié)功能障礙，水、電解質代謝紊亂，引起中樞神經系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)障礙產生各種臨床癥狀的總稱。因溫室效應導致全球氣候變暖，中暑逐漸成為夏季的一種常見病和多發(fā)病，在高溫環(huán)境下進行野外日常軍事訓練的官兵，從事高強度的體力作業(yè)，其發(fā)病率及死亡率均逐年上升，故近年來軍隊已將防中暑寫入新版的共同條

2、令。相關研究提示，當機體體溫升高致腸粘膜上皮細胞的阻力下降，引起細胞旁路開放增加，導致腸道內毒素(endotoxin，ET)及其所介導的炎性介質大量進入機體的血液循環(huán)，形成腸源性內毒素血癥(intestinal endotoxemia)；而腸源性內毒素血癥在中暑過程中的作用及預后影響也逐漸引起醫(yī)學界的高度重視。目前相關研究認為氧化應激反應及腸源性內毒素血癥是中暑和其并發(fā)癥發(fā)生的重要病理生理學基礎。腸粘膜屏障功能作為機體免疫防御系統(tǒng)的重要

3、組成部分之一，在整個中暑的應激過程中可能發(fā)揮著十分重要的作用。
　　 中暑的病因十分復雜，決定了其預防及治療方法應針對不同的發(fā)病機制，單一用藥往往難以取得較好的效果，聯(lián)合用藥、多環(huán)用藥療效確切。谷氨酰胺是一種高效抗氧化劑，它可直接作用于腸粘膜上皮細胞，并對腸粘膜上皮細胞的分化、增值、修復和再生有很強的促進作用，可有效減少腸道內毒素及其炎性介質入血，對腸粘膜結構和屏障功能起到積極的保護作用。維生素C亦是一種高效抗氧化劑，對機體產生

4、的氧自由基有很強的清除作用，它可以降低氧化應激反應，有效減輕組織損傷并促進組織修復，提高腸粘膜屏障防御功能，降低腸源性感染發(fā)生幾率，從而對熱應激致中暑產生有效的保護作用。Toll受體在中暑所致的全身性內毒素血癥的發(fā)病機制方面起著引導作用，TLR2受體作為Toll家族的重要組成之一，在連接細胞間相互作用及主導信號傳輸方面起著重要作用，并與機體產生的特定基因表達及細胞外信號傳導中起著橋梁作用，被公認為是機體炎癥反應的啟動閘門之一，已經成為醫(yī)

5、學領域的研究熱點。HSF1作為一個重要的轉錄調控因子，可以通過調控其下述的信號傳遞通路發(fā)揮其在熱應激反應中的功能，正確闡述HSF1分子的作用機制也逐漸成為醫(yī)學領域一個非常重要的研究方向。為研究藥物對熱應激致大鼠腸源性內毒素血癥的預防作用，我們應用臨床常用的谷氨酰胺聯(lián)合維生素C來進行中暑的預防用藥，在延續(xù)前期人體實驗的基礎上通過動物實驗從機制方面進一步研究。通過熱應激耐力實驗檢測SD大鼠小腸組織的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)

6、、血清內毒素含量的變化及TLR2mRNA的表達；通過高溫致死實驗觀察各組受試大鼠的存活時間，檢測熱休克轉錄因子1(HSF1)的表達變化及小腸組織超微結構的改變，來進一步探討谷氨酰胺聯(lián)合維生素C對熱應激致腸源性內毒素血癥的發(fā)生機制及對中暑的預防效果，為臨床藥物預防中暑提供理論依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1、SD大鼠熱應激耐力實驗：將160只Sprague-Dwley(SD)健康雄性大鼠，12-14周齡，體質量(205±

7、25)g，按照隨機數(shù)字表法分為5組：谷氨酰胺聯(lián)合維生素C組、谷氨酰胺組、維生素C組、高溫應激組、正常對照組。將前四組同時放入人工氣候箱中，模擬高溫中暑環(huán)境模型，每天應激2小時后取出；正常對照組放置于室溫。人工氣候箱內模擬溫度為：(38±1)℃、相對濕度為：(65±10)%。谷氨酰胺腸溶膠囊灌胃劑量為216 mg/(kg·d)，維生素C片灌胃劑量為135mg/(kg·d)，均1次/天。同批次應激各組均于每天實驗前60min給藥，用生理鹽水

8、5ml溶解稀釋后行大鼠灌胃。單一用藥組分別給予單一灌胃，聯(lián)合用藥組給于兩種藥物聯(lián)合灌胃，高溫應激組用生理鹽水5ml灌胃。實驗前各組均可自由進食進水，實驗過程中禁食禁水，實驗后可繼續(xù)自由進食進水。分別于應激后第1、3、7、15d用4mg/Kg的2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉取清潔小腸組織放置于液氮罐中，并立即心臟采血2-3ml注入專用的無熱源試管內，以4000r/min離心10min，取上層血清樣本存放于-20℃冰箱，統(tǒng)一進行相關指標檢測。取標本

9、前24h禁食，4h禁水。運用RT-PCR技術檢測小腸組織Toll樣受體2(TLR2)mRNA的表達，從機制上探索腸粘膜屏障功能在熱應激致腸源性內毒素血癥中的變化。
　　 2、SD大鼠高溫致死實驗：將40只Sprague-Dwley(SD)健康雄性大鼠，11-13周齡，體質量(200±15)g，清潔級，隨機分為谷氨酰胺聯(lián)合維生素C組、谷氨酰胺組、維生素C組、高溫應激組、正常對照組，每組8只。將前四組同時放入人工氣候箱中持續(xù)行高溫應

10、激，人工氣候箱內溫度為：(41±0.5)℃、相對濕度為：(65±20)%；正常對照組放置于室溫。待高溫致死后立即取小腸組織，隨機分為三份，一份存放于液氮罐中進行相關指標檢測；一份用10%多聚甲醛固定分別行HE染色實驗觀察小腸組織結構及免疫組化實驗檢測HS目的表達；另一份用2.5%戊二醛固定行透射電鏡實驗觀察小腸粘膜上皮細胞超微結構的改變。
　　 實驗結果：
　　 1、SD大鼠熱應激耐力實驗結果顯示：(1)與正常對照組相比

11、，在同時間段高溫應激各組SOD含量明顯降低，而MDA、血清內毒素、TLR2mRNA表達量均明顯升高(p<0.05)，三個藥物干預組SOD、MDA含量同比無明顯差異(p>0.05)，單用谷氨酰胺組、維生素C組血清內毒素含量及TLR2mRNA表達量均明顯升高(p<0.05)，谷氨酰胺組聯(lián)合維生素C組血清內毒素含量及TLR2mRNA表達量無明顯差異(p>0.05)。(2)與高溫應激組比較，在同時間段三個藥物干預組SOD含量均顯著升高(除第7天

12、谷氨酰胺組、維生素C組外)；而MDA、內毒素含量及TLR2mRNA表達量均明顯降低(除第3天、第15天的維生素C組TLR2 mRNA表達量外)(p<0.05)。(3)與谷氨酰胺組、維生素C組比較，同時間段谷氨酰胺聯(lián)合維生素C組SOD含量較相近，但MDA和血清內毒素含量及TLR2mRNA表達量均明顯降低(p<0.05)。
　　 2、SD大鼠高溫致死實驗結果顯示：(1)與同時間段高溫應激組比較，三種藥物干預組大鼠的存活時間明顯延長(

13、p<0.05)；同時間段谷氨酰胺聯(lián)合維生素C組大鼠的存活時間明顯長于單用谷氨酰胺組、維生素C組(p<0.05)。(2)同時間段谷氨酰胺聯(lián)合維生素C組HS目的光密度均值明顯高于正常對照組及高溫應激組(p<0.05)，單用谷氨酰胺組及維生素C組HS目的光密度均值與正常對照組及高溫應激組相比無明顯差異(p>0.05)；同時間段聯(lián)合用藥組與單一用藥組相比，HS目的光密度均值無明顯差異(p>0.05)。(3)透射電鏡觀察谷氨酰胺聯(lián)合維生素C組小腸

14、粘膜微絨毛、細胞核、細胞質及內質網基本正常，受損較輕；單用谷氨酰胺組細胞核可見均勻化改變，單用維生素C組可見細胞核及細胞質水腫、電子密度降低等改變；而高溫應激組的小腸粘膜細胞受損較重，微絨毛紊亂，胞漿、胞核溶解，內質網、線粒體均明顯腫脹。同批次實驗中，藥物干預組的SD大鼠的存活及對熱應激的耐受時間較高溫對照組延長，以聯(lián)合用藥組最為明顯。
　　 結論：
　　 本課題研究結果表明：
　　 一、作為小腸組織粘膜營養(yǎng)物質

15、能量來源及抗氧化應激制劑，谷氨酰胺聯(lián)合維生素C可有效減少高熱應激對小腸組織黏膜屏障的損傷，同時可以促進小腸組織粘膜的修復，保護小腸黏膜屏障功能，有效的降低腸源性內毒素血癥的發(fā)生，可用于熱應激致腸源性內毒素血癥及高溫中暑的預防。
　　 二、谷氨酰胺聯(lián)合維生素C預防腸源性內毒素血癥及高熱中暑的機制可能為：
　　 1.升高熱應激后小腸組織SOD含量，降低MDA、TLR2mRNA的含量，可有效抑制氧自由基，降低氧化應激反應，可抑