ASCs結合可降解PLLA-PCL納米纖維支架構建功能性尿道的可行性研究.pdf

1、研究背景與目的:平滑肌是尿道的主要功能成分。平滑肌細胞是一種終末分化細胞，一旦受損后很難再生，而且也缺乏合適可替代的肌體組織，因此修復長段尿道的缺損一直是臨床上的難題。有些研究者嘗試通過脈管系統(tǒng)活檢獲得平滑肌細胞，然后在體外培養(yǎng)擴增細胞，制備具有機械性能和收縮功能的組織工程肌肉組織。然而這些成熟的平滑肌細胞在體外增殖能力有限，而且多次分化后，容易失去其收縮能力。最為重要的是，體外培養(yǎng)出來的平滑肌排列無規(guī)律，因此細胞收縮時，所有細胞不能朝

2、同一方向收縮，難以實現(xiàn)平滑肌細胞群整體的收縮功能。通過組織工程的方法來制備功能性的尿道，需要解決的兩個重要的問題就是尋找到理想的種子細胞和合適支架材料，進而培育出具有方向性排列的平滑肌細胞群。
　　 干細胞是一類處于未分化狀態(tài)的細胞，它們具有自我更新能力，而且在一定條件下，能向多種成熟細胞類型分化。盡管胚胎干細胞（ESCs）具有多向分化的潛能，但受倫理、宗教、道德和法律的制約，它們的使用受到限制。自成體組織來源的成體干細胞就不受

3、這些因素的制約，而且因為可以從自體組織取材，能避開免疫排斥反應。脂肪干細胞(ASCs)就是一種存在于機體脂肪組織的成體干細胞，它們能夠比較容易的從脂肪組織提取，而且體外培養(yǎng)時，顯示了很強的增殖能力和向多種細胞類型分化的潛能。例如向脂肪、骨、軟骨、骨骼肌、平滑肌組織分化。而且ASCs具有易于大量獲得、取材方便的優(yōu)點，因此可作為用于尿道重建組織工程的“種子細胞”。
　　 良好的生物材料支架植入機體后，能夠與細胞、機體組織和諧共存。種

4、子細胞與支架材料在體外共培養(yǎng)后，植入體內受損組織部位，能夠對機體大塊組織缺損進行修補。支架材料分為非可降解材料和可降解材料兩類。非可降解材料不能被機體吸收而留在體內，往往不能很好的替代機體組織的功能，如自我更新，新陳代謝及自我優(yōu)化能力等?？山到獠牧夏軐κ軗p組織進行形態(tài)、結構及功能上的修復，它們降解為對機體無毒害的CO2和水分子，僅留下支架材料上搭載的細胞與組織融合。本實驗所用的PLLA/PCL材料（聚乳酸/聚已內酯）是可降解的聚乳酸(P

5、LLA)和聚已內酯(PCL)的共混,通過調整兩者的比例可以控制合成材料的柔韌性、伸展性和降解時間，因而制備出組織修復與重建理想的可降解生物支架。
　　 本課題應用PLLA、PCL作為原材料，應用靜電紡絲技術制備具有方向性的納米纖維細胞支架，并采用不同細胞外基質來改良材料的粘附性能，體外將自體ASCs在納米支架上誘導為平滑肌細胞，以期在體外構建出具有整體收縮功能的平滑肌細胞群移植物。實驗中研究了不同組份材料與細胞及組織的生物相容性

6、，細胞外基質對材料細胞親和力以及ASCs向SMCs分化的影響。而且成功將ASCs誘導為平滑肌細胞（AD-SMCs）后，將帶AD-SMCs支架接種于兔尿道缺損模型，比較移植前后兔尿道壓變化，為探討ASCs結合方向性PLLA/PCL納米纖維支架構建功能性尿道的可行性打下了實驗基礎。
　　 材料和方法:
　　 一．ASCs分離、培養(yǎng)、鑒定和PLLA/PCL納米纖維支架篩選。
　　 1．ASCs的分離及培養(yǎng)采用從新西蘭大

7、白兔（雌、雄各半）腹股溝區(qū)皮下脂肪、頸背部皮下脂肪、腎臟周圍脂肪組織分離出的ASCs作為實驗細胞。ASCs分離技術參照Zuk的方法[1]：將兔不同部位取材的新鮮脂肪組織（約1.5g）置入無菌PBS液沖洗后，在含10％FBS的DMEM中剪成1-2mm碎塊；無菌PBS反復洗脫，去除混雜的血細胞和脂肪細胞；置于振蕩器內，37℃下0.1％膠原酶消化2小時；等體積含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中止膠原酶反應；250g離心10分鐘，取下層細胞團塊

8、；含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基分散細胞團塊，將細胞濃度調整至1*106/ml后移入無菌培養(yǎng)瓶中；37℃、5％CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2．ASCs鑒定流式細胞儀檢測體外培養(yǎng)ASCs表面的干細胞標記性分子CD106、CD166；細胞免疫組織化學檢測CD31、CD45、CD105。
　　 3．不同部位ASCs體外增殖能力的比較MTT法檢測從腹股溝區(qū)皮下脂肪、頸背部皮下脂肪、腎臟周圍脂肪組織分離出的ASC

9、s第2代細胞第1、2、3、4、5、6、7天的增殖情況，比較三個不同部位來源ASCs增殖能力的差異。
　　 4．PLLA/PCL納米纖維支架的制備利用靜電紡絲的方法制備PLLA/PCL納米纖維支架。參考Ma的方法[11]，基本步驟如下：取10ml的20％的PLLA/PCL氯仿溶液，加入20ml的注射器，注射器由氣泵勻速推注(0.5ml/h),使溶液通過一20G（內徑0.21mm）的針頭。在針頭與接收納米纖維的鋁片之間（距離20-4

10、0cm）加高電壓（15kv），這樣PLLA/PCL氯仿溶液就會從針頭高速噴出。在其向接收裝置運動的過程中，溶劑氯仿迅速蒸發(fā)，鋁片上收集到飄落的PLLA/PCL納米纖維。當接收納米纖維的鋁片改為一勻速旋轉的接收裝置（鋁盤）時，納米纖維便能以一定的方向排列在鋁盤上。鋁片上PLLA/PCL納米纖維絲聚集到一定厚度（0.2-0.4mm）時收集材料。掃描電鏡將用于納米纖維的形態(tài)觀察。
　　 二．細胞外基質(ECM)改良PLLA/PCL納米

11、纖維支架性能
　　 1．不同ECM（明膠、膠原、層粘連蛋白(LN)、纖維鏈接蛋白(FN)、高濃度多聚賴氨酸、低濃度多聚賴氨酸）處理96孔板及1：1 PLLA/PCL納米纖維支架，MTT法檢測不同ECM處理前后，96孔板中細胞增殖能力變化；免疫熒光染色及掃描電鏡比較支架材料不同ECM處理前后，細胞粘附能力變化。
　　 2．不同ECM（明膠、膠原、層粘連蛋白(LN)、纖維鏈接蛋白(FN)、高濃度多聚賴氨酸、低濃度多聚賴氨酸）

12、預處理培養(yǎng)皿后種植ASCs，在平滑肌誘導培養(yǎng)基(SMIM)中誘導ASCs向平滑肌方向分化。RT-PCR和Realtime-PCR檢測不同時相，普通培養(yǎng)皿和ECM處理培養(yǎng)皿內誘導細胞平滑肌特異性標記基因（Calponin、SM22、a-SMA、MHC）mRNA的表達及表達量的變化；Westernblot檢測其蛋白質的表達水平。進而比較不同ECM對ASCs向平滑肌方向分化的影響。
　　 三．方向性PLLA/PCL納米纖維支架上ASC

13、s成平滑肌分化及兔尿道重建
　　 1．制備具有方向性的PLLA/PCL納米纖維支架，掃描電鏡檢測材料的方向性。
　　 2．ASCs與方向性的PLLA/PCL納米纖維支架在普通培養(yǎng)基（DMEM）中共培養(yǎng)，免疫熒染色、掃描電鏡及MTT法檢測材料上細胞的粘附、增殖。
　　 3.ASCs結合使用或不使用LN預處理的PLLA/PCL納米纖維支架在平滑肌誘導培養(yǎng)基（SMIM）中共培養(yǎng)，掃描電鏡觀察LN處理前后，ASCs的粘附

14、、分化及誘導出的平滑?。ˋD-SMCs）的排列。
　　 4.兔尿道狹窄模型的建立及帶細胞支架兔尿道修復應用鈥激光在直視下對兔尿道行破壞，術后3-4周逆行尿路造影顯示尿道狹窄形成。從該兔腹股溝區(qū)取脂肪組織，分離出ASCs 并在體外培養(yǎng)增殖。將擴增的細胞種植于方向性纖維支架上，普通培養(yǎng)基（DMEM）內培養(yǎng)一周，細胞增殖密集后，換用誘導培養(yǎng)基（SMIM）誘導ASCs向平滑肌分化。成功誘導ASCs 為AD-SMCs后，將帶細胞支架移植于

15、ASCs 來源兔尿道內，不同時間點檢測兔尿道壓變化（2周、8周），并與尿道狹窄模型建立前，兔尿道壓相對比，評估帶細胞支架的治療效果。
　　 結果：
　　 1．從兔三個不同部位分離出的細胞都具有脂肪干細胞典型的三角形或梭形外觀，流式細胞儀檢測細胞表面CD106、CD166 陽性率同脂肪干細胞吻合。
　　 2．不同部位ASCs 體外增殖能力MTT 法檢測，差異有顯著性（P<0.05）。頸背部增殖能力最強，其次為腹股溝

16、區(qū)，腹膜后脂肪來源（腎周脂肪）增殖能力最弱。
　　 3．電鏡下觀測靜電紡絲技術成功制備出具有方向性的纖維支架材料。
　　 4．免疫熒光活死細胞染色（Live/Dead Stain）檢測，不同組分PLLA/PCL納米纖維支架均無明顯細胞毒性。免疫熒光活死細胞染色和掃描電鏡觀測不同時間點（1、2、3天）固定面積視野細胞計數(shù)，1：1 支架材料細胞粘附能力最強，不同材料上細胞增殖能力沒有明顯差異。
　　 5．不同支架材料

17、種植與SD 大鼠背部皮下后，第5天、第2、3、4、6、8、12周免疫組化染色。僅僅第5天時，炎性因子CD31、CD45、CD68 有陽性表達，第2、3、4、6、8、12周免疫組化檢測炎癥因子CD31、CD45、CD68 均無明顯陽性表達，并觀察到材料逐漸破碎降解，第12周時，基本看不到組織中材料成分，而且材料種植部位無肉芽組織形成。
　　 6．倒置像差顯微鏡下，計數(shù)不同ECM 處理材料（1：1 材料）后，相同面積材料上粘附的細胞

18、數(shù)與未用ECM 處理材料上細胞數(shù)對比，ECM 處理后各組相同面積材料粘附數(shù)與未處理組有明顯差異。
　　 7．不同ECM 處理培養(yǎng)皿中細胞增殖能力與未處理培養(yǎng)皿中細胞增殖能力對比，PLL 高濃度組、PLL 低濃度組、FN組與對照組有明顯差異；明膠、膠原、LN 處理組與對照組無明顯差異。
　　 8．不同ECM 處理培養(yǎng)皿后接種ASCs，在誘導培養(yǎng)基中誘導6周。Realtime-PCR檢測顯示不同ECM 處理組，平滑肌特異性基

19、因表達水平均隨誘導時間延長而升高，6周時各種處理因素平滑肌特異性基因表達水平達到基本一致水平（成功誘導為SMCs）。LN、明膠、膠原能加速平滑肌細胞特異性基因表達。平滑肌細胞Western blot 檢測顯示LN、明膠、膠原組誘導2w 檢測出calponin；FN、PLL（高、低濃度）、對照組2w 未檢測到calponin。明膠、膠原、LN、正常對照組細胞誘導3w 檢測SM22；PLL(高、低濃度)、FN 處理組未檢測出。PLL(高、低

20、濃度)、FN、膠原、LN、明膠組細胞誘導4w 檢測出a-actin。PLL(高、低濃度)、明膠、膠原、LN、FN組細胞誘導6w 檢測出MHC 蛋白表達。
　　 9．靜電紡絲技術結合電轉制備1：1 PLLA/PCL納米纖維支架，掃描電鏡下觀察支架上納米纖維具有一致的方向性。
　　 10．普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周，免疫熒光染色、掃描電鏡檢測到1：1 方向性PLLA/PCL納米纖維支架材料上細胞數(shù)量逐漸增加。
　　 11．

21、1：1 方向性PLLA/PCL納米纖維支架材料上細胞在誘導培養(yǎng)基（MCDB131）中培養(yǎng)6周時，掃描電鏡檢測顯示支架材料上細胞排列具有方向性。細胞長軸方向與支架材料上，納米纖維方向相同。
　　 12．鈥激光在直視下對家兔尿道進行沖擊，術后3-4周兔尿道造影檢查可見尿道狹窄形成。將帶AD-SMCs的支架植入ASCs 來源的兔尿道，第2周與第8周檢測兔尿道壓，第2周時兔尿道壓顯示存在尿道狹窄，第8周時，部分兔（2/4）顯示正常兔尿道

22、壓。
　　 結論：
　　 1．腹股溝區(qū)來源ASCs 取材容易且增殖能力強，是合適的ASCs 來源。
　　 2．1：1 PLLA/PCL納米纖維支架無細胞毒性、細胞粘附性好、組織炎癥反應小，是合適的生物支架。
　　 3．ECM 能改良材料的粘附性；LN、明膠、膠原能促進ASCs 向平滑肌細胞分化。
　　 4．1：1 方向性PLLA/PCL納米纖維支架上能培養(yǎng)出具有方向性的平滑肌細胞。