間充質(zhì)干細胞對骨肉瘤的趨向性及促進其生長和轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、目的： 文獻報告間充質(zhì)干細胞(MSCs)與腫瘤細胞之間存在復雜的相互作用。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，干細胞與骨肉瘤細胞混合后接種于裸鼠脛骨髓腔，形成的腫瘤明顯大于骨肉瘤細胞單獨接種時。本研究擬在此基礎上，進一步通過荷瘤鼠尾靜脈注射報告基因標記的間充質(zhì)干細胞，探討其對骨肉瘤病灶的趨向性及對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響，并初步探討間充質(zhì)干細胞對骨肉瘤趨向及影響骨肉瘤生長的機制。 方法： 1.細胞培養(yǎng)：建立骨肉瘤動物模型的人骨肉瘤

2、細胞（Saos-2）購于中科院上海生命科學研究院，置于37℃、5％CO2 培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清和1％雙抗的α－MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，三天后按照1：3的比例傳代。hMSCs 分離自年輕正常人的骨髓，采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)，用含10％FBS和1％雙抗的α－MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，三天后按照1：3的比例傳代。采用3～4代的hMSCs，在hMSCs 90％融合后滴加用α－MEM 培養(yǎng)液稀釋的攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因的腺病毒液4 ml轉(zhuǎn)染過

3、夜（MOI＝150），換液后繼續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察hMSCs轉(zhuǎn)染GFP基因的效率。 2. 骨肉瘤動物模型的建立及分組：29 只4周齡健康雄性裸鼠，購于中科院上海生命科學研究院。23 只裸鼠向裸鼠右后脛骨近端骨髓腔內(nèi)注射50 μl Saos-2細胞懸液（107個），建立原發(fā)性骨肉瘤動物模型；4周后骨肉瘤病灶明顯時按隨機化原則分為2組，A組（OS組，n=11）、B組（OS+hMSCs組，n=12）。未建立骨肉瘤動物模型的6 只動

4、物作為C組（hMSCs組，n=6）。A組動物作為陽性對照組，形成腫瘤后繼續(xù)觀察，不作任何處理；B、C組動物經(jīng)尾靜脈注射50 μl 106個GFP標記的hMSCs懸液（GFP-hMSCs），作為實驗組及陰性對照組。 3. 動物模型的觀察和檢測:（1）裸鼠體重和腫塊生長情況。于接種Saos-2細胞后第4周開始，每周測量一次裸鼠體重及腫瘤部位腫塊長和寬，按照文獻報告的方法計算腫瘤體積大小，繪制裸鼠體重和腫瘤體積的生長曲線。（2）A、B

5、組裸鼠血清中ALP活性檢測。于第12周時用0.5％戊巴比妥鈉（0.1 ml/10g）腹腔麻醉裸鼠，經(jīng)裸鼠心臟部位取血，離心后取血清用p-NPP法測量比較兩組裸鼠血清中ALP的活性。（3）腫瘤部位的X 線檢查。12周取材時分離各只裸鼠的患肢，X 線檢查腫瘤對骨組織的破壞情況。（4）12周取材時分離裸鼠的腫瘤組織和肺組織，X 線檢查完畢后，一半進行冰凍切片，直接熒光顯微鏡下觀察并利用GFP抗體、SDF-1 抗體、CCL5 抗體行免疫組織化學

6、檢測；一半用福爾馬林溶液固定，脫鈣后行常規(guī)HE 染色觀察腫瘤的形成、對骨質(zhì)的破壞情況及肺臟轉(zhuǎn)移情況。 4.體外分析SDF-1/CXCR4 信號通路在間充質(zhì)干細胞對骨肉瘤趨向中的作用：利用細胞免疫化學及western blot 分別檢測hMSCs和Saos-2 上是否有SDF-1 及CXCR4 陽性表達。SDF-1 Elisa 試劑盒測定間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基、Saos-2細胞條件培養(yǎng)基中SDF-1的表達量，利用SDF-1中和抗體

7、阻斷條件培養(yǎng)基中SDF-1的表達，利用transwell 裝置檢測不同培養(yǎng)液對hMSCs 及Saos-2細胞遷移能力的影響。 5.體外分析CCL5/CCR5 通路在間充質(zhì)干細胞促進骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移和生長中的作用：利用細胞免疫化學方法檢測hMSCs 上是否有CCL5 表達，western blot檢測Saos-2細胞上是否有其受體CCR5 表達。利用transwell 裝置和MTT 方法檢測hMSCs上清對Saos-2細胞遷移和增殖

8、能力的影響，以及CCL5中和抗體阻斷后細胞遷移和增殖能力的變化。 結果： 1.外源性的間充質(zhì)干細胞可以趨向到骨肉瘤部位：冰凍切片的裸鼠腫瘤組織在鏡下可見有綠色熒光。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)腫瘤組織局部有GFP的陽性表達，提示hMSCs 趨向并整合到了腫瘤組織內(nèi)。 2.間充質(zhì)干細胞促進骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移：間充質(zhì)干細胞注射后8周，OS+hMSCs組的腫瘤體積明顯大于OS組，且注射hMSCs 后裸鼠體重明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義

9、（P<0.05）；血清ALP水平在OS+hMSCs組也明顯高于OS組。X 線片證實OS+hMSCs組裸鼠骨肉瘤部位骨組織破壞程度明顯高于OS組。肺組織切片證實OS+hMSCs組裸鼠肺轉(zhuǎn)移率明顯高于OS組（P<0.01）。以上結果提示間充質(zhì)干細胞可以促進骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移。 3. SDF-1/CXCR4 信號途徑調(diào)節(jié)hMSCs 向Saos-2細胞的遷移：細胞免疫化學結果顯示Saos-2細胞上有SDF-1 陽性表達，western b

10、lot 證實hMSCs 上有CXCR4 陽性表達。利用SDF-1中和抗體阻斷條件培養(yǎng)基中SDF-1的表達可以明顯降低hMSCs及Saos-2細胞的遷移能力（P<0.01）。 4. 間充質(zhì)干細胞通過CCL5/CCR5 信號途徑促進Saos-2細胞的遷移和生長：細胞免疫化學結果顯示hMSCs 上有CCL5 陽性表達，western blot 證實Saos-2細胞上有CCR5 表達。間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基可以顯著促進Saos-2細胞的