葉酸對體外缺氧新生大鼠神經(jīng)干細胞保護作用的研究.pdf

1、目的:
　　研究葉酸(folicacid，F(xiàn)A)對體外培養(yǎng)的缺氧神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)增殖能力、凋亡率、抗氧化能力和線粒體通路相關蛋白表達的影響，探討葉酸對體外缺氧NSCs的保護作用及其可能機制。
　　方法:
　　采用無血清體外細胞培養(yǎng)方法，培養(yǎng)新生大鼠NSCs，將NSCs分為5組：
　　①正常對照組(Normolcontrolgroup)葉酸濃度為4μg/ml；②缺氧模型組(Hy

2、poxiamodelgroup)葉酸濃度為4μg/ml；③缺氧葉酸低劑量組(Hypoxia+folicacidLgroup)葉酸濃度為81μg/ml；④缺氧葉酸高劑量組(Hypoxia+folicacidHgroup)葉酸濃度為44μg/ml；⑤缺氧葉酸缺乏組(Hypoxia+folicacidDgroup)葉酸劑量為0.65μg/ml；于增殖第3d將除正常對照組外的其他4組細胞進行缺氧培養(yǎng)8h。用MTT法檢測缺氧損傷后神經(jīng)干細胞的活力

3、，繪制生長曲線；用ELISA試劑盒檢測各組細胞培養(yǎng)液中同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平；用熒光分光光度計檢測細胞內(nèi)活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)水平；培養(yǎng)6d后收集增殖期細胞，提取細胞蛋白，并采用試劑盒檢測細胞內(nèi)抗氧化指標：超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-Px)和丙二醛(mal

4、eicdialdehyde，MDA)的水平；采用流式細胞儀檢測NSCs凋亡率和線粒體跨膜電位：采用Westernblot方法檢測各組細胞線粒體凋亡通路相關蛋白(Caspase-3、Bc1-2、Bax)表達。
　　結(jié)果:
　　缺氧后NSCs形態(tài)學出現(xiàn)損傷跡象，葉酸可產(chǎn)生一定保護作用。MTT結(jié)果顯示，缺氧后各時間點，正常對照組細胞活力高于缺氧模型組和葉酸缺乏組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，缺氧葉酸高劑量組細胞活力高于缺氧葉

5、酸低劑量組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ELISA測定各組NSCs培養(yǎng)液中的Hcy結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉酸添加組均低于正常對照組，且具有一定的劑量反應關系。與正常對照組相比，缺氧模型組和缺氧葉酸缺乏組SOD、GSH-Px活性降低，MDA和ROS水平升高(P<0.05)；葉酸添加組SOD、GSH-Px活性升高，MDA和ROS水平降低(P<0.05)。流式細胞檢測結(jié)果顯示，缺氧模型組NSCs凋亡率高于正常對照組(P<0.05)和葉酸添加組，

6、低于葉酸缺乏組，線粒體跨膜電位水平低于正常對照組和葉酸添加組(P<0.05)，高于葉酸缺乏組；Westernblot方法測定各組NSCs內(nèi)線粒體通路相關蛋白的表達結(jié)果顯示，缺氧模型組活性Caspase-3和Bax表達量高于正常對照組和葉酸添加組(P<0.05)，低于葉酸缺乏組(P<0.05)，Bc1-2表達量低于正常對照組和葉酸添加組(P<0.05)，高于葉酸缺乏組(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　本實驗成功建立體外新生S