硫化氫對(duì)新生大鼠HIBD神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的研究.pdf

1、研究背景：新生兒缺氧缺血性腦損傷（HIBD）是導(dǎo)致新生兒死亡和神經(jīng)系統(tǒng)永久性損傷的重要原因之一。將遺留腦性癱瘓、學(xué)習(xí)障礙、智力低下、癲癇、精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲滯等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。研究發(fā)現(xiàn)0.2～0.4％的足月兒在分娩中窒息，其中15～20％因繼發(fā)新生兒缺氧缺血性腦損傷死亡，幸存者近25％存在神經(jīng)系統(tǒng)障礙。隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)室的建立及醫(yī)療技術(shù)水平的提高，中、重度新生兒窒息患兒的存活率顯著提高，但存活兒中神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)病率仍較高。因此深入探討

2、HIBD發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療措施提高HIBD的治愈率和降低神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥有重要意義。
　　 HIBD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其核心是因?yàn)槿毖跛?，主要病變部位為皮質(zhì)、海馬、基底節(jié)、丘腦等部位，由多種機(jī)制共同導(dǎo)致的缺氧缺血性生化連鎖反應(yīng)包括:①缺氧早期腦內(nèi)血液動(dòng)力學(xué)改變。②腦細(xì)胞能量代謝的變化。③興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用。④氧自由基的作用。⑤Ca2+內(nèi)流與再灌注損傷。⑥NO、炎癥因子及細(xì)胞因子的作用。⑦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。實(shí)驗(yàn)證明神經(jīng)元細(xì)

3、胞的凋亡是缺氧缺血性腦損傷發(fā)病機(jī)制中重要作用之一。
　　 硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)后第三種小分子量氣體信號(hào)分子，對(duì)H2S最早的認(rèn)識(shí)是作為有毒氣體，但在90年代后期發(fā)現(xiàn)其生理濃度是一種新型氣體信號(hào)分子，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性H2S廣泛存在于哺乳動(dòng)物的組織及器官中，在生理濃度時(shí)通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)形式及調(diào)節(jié)方式發(fā)揮廣泛病理生理作用。1996年Abe等首次證實(shí)內(nèi)源性H2S是一種神經(jīng)活性分子，參與神經(jīng)調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的

4、過(guò)程。內(nèi)源性H2S的生成受體內(nèi)胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)兩種關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)。CBS主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)，如海馬、皮層、小腦、腦干等，而CSE則以神經(jīng)系統(tǒng)外組織為主。在體內(nèi)1/3以H2S氣體形式存在，2/3以硫氫化鈉(NaHS)形式存在，并在體內(nèi)水解為Na+和HS-，而HS-在與H+結(jié)合成H2S。研究證明大鼠腦內(nèi)內(nèi)源性H2S的濃度可達(dá)50～160μmol/L，而鼠腦內(nèi)游離的H2S生理濃度約14±3.0μmol/

5、L，其多種生理功能:①選擇性增強(qiáng)NMDA受體介導(dǎo)的興奮性電流而加強(qiáng)神經(jīng)反應(yīng)效應(yīng)。②調(diào)節(jié)突觸的活動(dòng)，影響海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)。③通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺軸調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌功能。④通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞調(diào)節(jié)大腦血供進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)功能。⑤通過(guò)上調(diào)γ-氨基丁酸(GABA)B受體進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放而調(diào)節(jié)興奮性。⑥調(diào)節(jié)胞內(nèi)外Ca2+平衡。⑦通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上CL-/HCO3-，Na+/H+離子通道調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PH值。⑧通過(guò)增

6、強(qiáng)γ-谷氨酰胺半胱氨酸合成酶(γ-GCS)活力以提高胞內(nèi)γ-谷氨酰胺半胱氨酸（γ-GC）含量，并同時(shí)加強(qiáng)半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)效率進(jìn)而增加胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)水平，經(jīng)抗氧化應(yīng)激而保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，⑨抗凋亡作用。而NO亦是氣體信號(hào)分子，起著信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)遞質(zhì)的作用，適量的NO可調(diào)節(jié)血管張力、免疫功能、神經(jīng)傳導(dǎo)及攻擊腫瘤細(xì)胞、殺死病原微生物等;過(guò)量的NO則具有神經(jīng)毒性導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。H2S與NO之間有相互作用，H2S可抑制NOS活性，減少NO生

7、成，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用。
　　 生后7d新生SD大鼠大腦組織與新生兒腦發(fā)育相似，并且SD大鼠頸總動(dòng)脈形成的Willis環(huán)和腦的血液供應(yīng)與人類(lèi)相似，而且在缺氧缺血條件后其血流動(dòng)力學(xué)變化、能量代謝及繼發(fā)性能量衰竭等病理生理學(xué)改變與新生兒缺氧缺血性腦損傷極其相似。加之大鼠模型制備相對(duì)簡(jiǎn)單并且死亡率相對(duì)低，因此目前廣泛利用7d新生SD大鼠參照Rice方法制備新生鼠HIBD動(dòng)物模型。任彩麗等發(fā)現(xiàn)在新生大鼠HIBD后腦皮質(zhì)中H2S濃度成先

8、升高后降低的動(dòng)態(tài)變化。大量研究也證明H2S可減輕腦缺血-再灌注損傷而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用。因此在此基礎(chǔ)上，探索H2S對(duì)HIBD后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響，并通過(guò)干預(yù)措施了解H2S是否會(huì)影響細(xì)胞凋亡，探索一種新的干預(yù)方法。
　　 細(xì)胞凋亡是體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的過(guò)程，是與壞死不同的另一種細(xì)胞死亡形式。細(xì)胞凋亡對(duì)確保機(jī)體正常發(fā)育、生長(zhǎng)，及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用，而凋亡失調(diào)也是導(dǎo)致許多疾病發(fā)病的

9、機(jī)制之一并威脅著人類(lèi)的健康。
　　 CaspaSe家族始于線蟲(chóng)(C.elegans)細(xì)胞程序性死亡的研究，是存在于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，其共同點(diǎn)是特異斷裂天冬氨酸殘基后肽鍵。Caspase家族中caspase-1，4，11等主要參與前體的活化;Caspase-2，8，9，10參與細(xì)胞凋亡起始;caspase-3，6，7參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。Caspase-3是1996年命名，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中關(guān)鍵的終末剪切酶，也是CTL細(xì)

10、胞殺傷機(jī)制中重要部分之一。Caspase-3是多種細(xì)胞凋亡途徑的下游效應(yīng)部分的交匯點(diǎn)介導(dǎo)死亡受體作用，是凋亡蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。
　　 本研究構(gòu)建新生大鼠HIBD模型，觀察大鼠內(nèi)源性H2S和NO濃度變化及兩者的相關(guān)性，并通過(guò)給予外源性H2S供體硫氫化鈉(NaHS)和CBS抑制劑羥胺(HA)改變內(nèi)源性H2S及NO濃度，觀察HIBD后腦組織病理性改變，利用TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)caspase-3表達(dá)

11、的情況，探討H2S對(duì)新生兒缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 具體研究?jī)?nèi)容包括以下兩個(gè)部分:
　　 第一部分新生大鼠HIBD后腦組織H2S與NO濃度的變化
　　 目的：構(gòu)建新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）模型后觀察血清硫化氫(H2S)和腦組織H2S、NO濃度變化規(guī)律，并分析腦組織H2S與NO之間的相互作用。
　　 方法：124只7日齡新生SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=4)、假手術(shù)組(n=30)

12、、HIBD組(n=30)、HIBD+硫氫化鈉(NaHS)組(n=30)和HIBD+羥胺(HA)組(n=30)，HIBD組參照Rice方法制備新生鼠HIBD模型，假手術(shù)組僅予分離左頸總動(dòng)脈不予缺氧處理。HIBD+NaHS組予HIBD后30min給予NaHS(14μmol/kg)，HIBD+HA組予HIBD后30min給予HA(12.5mg/kg)，用生理鹽水稀釋后腹腔注射。分別于HIBD及干預(yù)后6h、12h、24h、48h及72h采血用生

13、化反應(yīng)方法檢測(cè)新生大鼠血清H2S濃度，分離左側(cè)大腦皮質(zhì)分別檢測(cè)腦組織H2S濃度及用硝酸還原酶法檢測(cè)NO濃度，假手術(shù)組及對(duì)照組檢測(cè)措施與HIBD組相同。分析HIBD后H2S和NO的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，并進(jìn)行H2S和NO相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果：HIBD后6h新生大鼠血清和腦組織H2S顯著升高，12h達(dá)到高峰，后逐漸降低;腦組織NO于6h后逐漸上升。給予H2S供體NaHS后血清和腦組織內(nèi)源性H2S在各時(shí)間點(diǎn)上較HIBD組明顯升高，相反NO

14、則下降;而給予酶抑制劑后內(nèi)源性H2S明顯降低，而NO則升高。血清H2S同一時(shí)間點(diǎn)中72h假手術(shù)組與HA組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HIBD組、NaHS組及HA組中6h與24h，HIBD組48h與72h，NaHS組24h與48h均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);腦組織H2S同時(shí)間點(diǎn)四組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。HIBD組6h與12h、12h與其他四個(gè)時(shí)間點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，NaHS組6h與24h，48h與72h，H

15、A組6h與48h、72h，12h與24h均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);腦組織NO6h時(shí)假手術(shù)組與NaHS組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。NaHS組中6h與12h無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。HIBD組、NaHS組腦組織H2S與NO負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.537、-0.838，P均＜0.05）。
　　 結(jié)論：H2S可能參與了HIBD新生大鼠的病理生理過(guò)程。給予NaHS和HA后內(nèi)源性H2S和NO的動(dòng)態(tài)變化，提示外源性干預(yù)能改變HI

16、BD新生大鼠內(nèi)源性H2S和NO濃度，為臨床提供一新的治療方法。
　　 第二部分硫化氫對(duì)新生大鼠HIBD后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的：探討H2S對(duì)新生大鼠HIBD的腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法：124只7日齡新生SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=4)、假手術(shù)組(n=30)、HIBD組(n=30)、HIBD+NaHS組(n=30)和HIBD+HA組(n=30)，分別于HIBD及干預(yù)后6h、12h、24h、48h及

17、72h取大腦皮質(zhì)、海馬觀察HE染色腦組織病理改變，檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)及caspase-3表達(dá)的平均光密度。
　　 結(jié)果：HE染色提示假手術(shù)組細(xì)胞排列整齊，形體基本正常，核仁清楚，無(wú)神經(jīng)細(xì)胞缺失;HIBD組左側(cè)腦組織細(xì)胞變性，排列紊亂，神經(jīng)元細(xì)胞明顯減少，可見(jiàn)變性壞死的神經(jīng)元的形成;NaHS組變性程度較HIBD組減輕，變性壞死的神經(jīng)元減少;HA組與HIBD組無(wú)明顯區(qū)別。假手術(shù)組大腦海馬和皮層可見(jiàn)少量凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。HIBD組損傷側(cè)

18、凋亡細(xì)胞6h開(kāi)始逐漸升高，至48h達(dá)到高峰后逐漸降低。NaHS組亦6h開(kāi)始逐漸升高，48h至高峰后降低，但各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞較HIBD組明顯減少。HA組凋亡細(xì)胞亦呈現(xiàn)逐漸升高至48h后降低趨勢(shì)，較HIBD組則顯著增加。HIBD組大鼠左側(cè)腦海馬和皮層區(qū)內(nèi)可見(jiàn)較多免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞caspase-3表達(dá)，6h開(kāi)始增多，12～24h逐漸升高，至48h后達(dá)到高峰分布密集后逐漸降低。HIBD+NaHS組左側(cè)腦海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞亦6h開(kāi)始逐漸升高，但12h

19、稍有下降，24h時(shí)再次上升至48h達(dá)到最高峰，72h陽(yáng)性細(xì)胞降低，較HIBD組減少，染色亦變淺。HA組海馬和皮層區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞亦呈現(xiàn)先上升后降低趨勢(shì)，與HIBD組比較明顯增多，染色加深。神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)，海馬區(qū)6h、12h、24h、48h假手術(shù)組與NaHS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，海馬中NaHS組6h分別與12h、24h、72h，12h分別與24h、72h，24h與72h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);皮層的HIBD組24h與7

20、2h，NaHS組6h與24h及24h與72h，HA組12h與24h、24h與72h及48h與72h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)，海馬中同一時(shí)間點(diǎn)上6h假手術(shù)組與NaHS組及HIBD組與NaHS組，12h假手術(shù)組與NaHS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);海馬中HIBD組6h與12h，12分別與24h、72h及24h與72h，NaHS組6h分別與12h、24h、72h及24h分別與48h、72h，HA組6

21、h與12h，12h與24h，24h與72h及48h與72h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。皮層的6h假手術(shù)組分別與HIBD組、NaHS組及HIBD組分別與NaHS組、HA組，12h、24h和72h假手術(shù)組與NaHS組，24h、72hHIBD組與HA組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);皮層中HIBD組6h與12h，12h與24h，24h分別與48h、72h及48與72h，NaHS組6h與12h，24h與72h及48h與72h，HA組12