納米纖維支架在細胞外微環(huán)境仿生構(gòu)建中的應(yīng)用研究.pdf

1、細胞外微環(huán)境在細胞的增殖、分化和組織的發(fā)生發(fā)育、恒常性維持以及損傷修復過程中都具有重要的生理功能,近年隨著組織工程和再生醫(yī)學研究的不斷深入和突飛猛進的發(fā)展,細胞外微環(huán)境的仿生構(gòu)建研究已成為生物學、醫(yī)學以及材料學等多學科共同關(guān)注的焦點。仿生構(gòu)建具有良好生理與生化特性的細胞外微環(huán)境不僅可以在體內(nèi)外為細胞提供三維生長空間,同時其還可進一步參與調(diào)控細胞的表型表達及其結(jié)構(gòu)/功能重建。本論文工作旨在依據(jù)生物學信息、利用材料學分子設(shè)計及靜電紡絲成型加

2、工技術(shù)仿生構(gòu)建具有納米纖維結(jié)構(gòu)的三維多孔支架,系統(tǒng)研究了支架本體及表面結(jié)構(gòu)、組成等物理、化學和生物學信號分子對內(nèi)皮細胞/干細胞的黏附、增殖及誘導分化功能表達的調(diào)控機制,并進一步開發(fā)具有特異性組織誘導功能的新型生物活性材料,為組織工程和再生醫(yī)學相關(guān)的細胞外微環(huán)境的仿生構(gòu)建提供理論和實踐指導。
　　 論文工作中首先通過提高靜電紡絲過程中接收轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速,制備了具有取向結(jié)構(gòu)納米纖維支架,并研究了其拓撲結(jié)構(gòu)及表面生物親和修飾對內(nèi)皮細胞的增

3、殖及分化功能表達等細胞行為的影響。掃描電鏡(SEM)觀察結(jié)果顯示納米纖維的取向結(jié)構(gòu)整齊均一,且內(nèi)皮細胞特異親和性透明質(zhì)酸的表面修飾未明顯改變?nèi)∠蚣{米纖維支架的物理結(jié)構(gòu)。同時,傅立葉紅外光譜分析表明低分子量的透明質(zhì)酸共價接枝到了經(jīng)氨解的聚己內(nèi)酯(PCL)納米纖維表面;該修飾使取向納米纖維支架的表面接觸角由105.2°變?yōu)?9.3°,顯著提高了支架表面的親水性。該支架進一步用于內(nèi)皮細胞培養(yǎng),其細胞形態(tài)分析結(jié)果表明,取向的納米拓撲形態(tài)可顯著促

4、進血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)的伸展,其表面的透明質(zhì)酸改性可促進細胞的粘附。血管性血友病因子(vWF)的免疫熒光檢測結(jié)果表明透明質(zhì)酸修飾取向納米纖維支架更有利于促進內(nèi)皮功能性基因的表達并快速誘導類內(nèi)皮層結(jié)構(gòu)形成。
　　 論文中還制備了控釋血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的梯度納米纖維(gCS/PCL)支架,進一步研究該控釋體系對支架表面內(nèi)皮化的影響。通過殼聚糖/聚己內(nèi)酯質(zhì)量梯度靜電共紡技術(shù)制備殼聚糖梯度納米纖維支架,后經(jīng)共價鍵制

5、備梯度肝素化納米纖維支架,最終經(jīng)生物親和力進一步制備VEGF的梯度分布及其緩慢釋放。本研究中利用熒光共聚焦顯微鏡、傅立葉紅外光譜分析、ELESA檢測及血小板黏附和抗凝血酶原時間測定等表征了所制備支架的理化學特性。結(jié)果表明,納米纖維支架基質(zhì)組分殼聚糖的梯度分布不僅提高了支架的肝素化程度,顯著抑制血小板的黏附,改善了制假的抗凝血性能;同時實現(xiàn)了支架表面VEGF的生物親和固定,與非梯度納米纖維支架相比,在釋放試驗的最初12小時內(nèi),VEGF的突

6、釋現(xiàn)象明顯被改善,可持續(xù)有效釋放VEGF近1周。且內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)MTT實驗和細胞骨架熒光染色實驗表明,裝載VEGF的梯度納米纖維支架更有助于HUVECs的粘附和快速增殖,并形成致密的內(nèi)皮細胞層。
　　 論文的最后一部分工作是為仿生構(gòu)建細胞微環(huán)境,通過基因工程技術(shù)構(gòu)建了內(nèi)皮細胞特異親和性融合蛋白細胞外基質(zhì)-VE-cad-Fc。分離擴增內(nèi)皮細胞鈣粘素胞外域并與免疫球蛋白Fc段進行基因融合構(gòu)建了真核表達載體,通過細胞轉(zhuǎn)染、蛋白表達

7、和純化獲得VE-cad-Fc融合蛋白。Western blotting和ELEAS檢測表明我們不僅成功生物合成了VE-cad-Fc融合蛋白,其分子質(zhì)量約為90.3KD,且該融合蛋白均以二聚體的形式存在。VE-cad-Fc基質(zhì)化表面培養(yǎng)內(nèi)皮細胞,MTT和細胞骨架熒光染色結(jié)果表明,VE-cad-Fc融合蛋白可顯有促進細胞的粘附和伸展,且其細胞黏附具有鈣離子依賴性。實時熒光定量PCR基因表達分析顯示,VE-cad-Fc融合蛋白基質(zhì)上調(diào)細胞表面