IL-15及mTOR抑制劑治療小鼠乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　應(yīng)用mTOR抑制劑(雷帕霉素靶蛋白抑制劑)聯(lián)合白細(xì)胞介素-15(Interle-ukin-15，IL-15)對小鼠乳腺癌進(jìn)行治療研究，觀察兩種治療方法聯(lián)合應(yīng)用與其單獨(dú)作用在控制腫瘤生長、延長患癌動(dòng)物生存期、延緩腫瘤轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)及調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡等方面的作用，探討治療作用的可能機(jī)制，為尋找治療乳腺癌的新方法提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　本實(shí)驗(yàn)首先通過脂質(zhì)體geneporter3000將IL

2、-15表達(dá)載體pHi2-spIL15-CMV-TAT(L3)及綠熒光蛋白表達(dá)載體pHi2-EGFP-CMV-TAT(L6)分別轉(zhuǎn)染4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞，采用倒置熒光顯微鏡評估細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，F(xiàn)CM分析腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及ELISA檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24小時(shí)及48小時(shí)后上清液中IL-15的濃度，分析IL-15基因表達(dá)情況，以確認(rèn)CMV啟動(dòng)子正調(diào)控IL-15基因表達(dá)質(zhì)粒載體在轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞后IL-15蛋白水平高效表達(dá)。
　　進(jìn)一步建立小鼠乳

3、腺癌移植瘤模型，分別以小鼠尾靜脈注射表達(dá)IL-15的L3治療載體，mTOR抑制劑依維莫司灌胃或聯(lián)合兩種治療途徑進(jìn)行干預(yù)，評估不同治療對荷瘤小鼠腫瘤大小、肝臟、肺臟轉(zhuǎn)移情況及生存期的影響；免疫細(xì)胞組織化學(xué)法比較各組腫瘤組織ki67、CD4、CD8、NKG2D表達(dá)差別；流式細(xì)胞計(jì)數(shù)對比各組小鼠外周血、脾臟及肝臟CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及CD16+CD32+自然殺傷細(xì)胞含量；Tunel法檢測腫瘤組織中細(xì)胞凋

4、亡情況。綜合各種檢測指標(biāo)及結(jié)果評估IL-15及mTOR抑制劑對小鼠乳腺癌的治療效果及機(jī)制。
　　研究結(jié)果：
　　1.依維莫司治療組、IL-15治療組和聯(lián)合治療組與對照組相比，腫瘤體積明顯縮小，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雙重治療組與單純依維莫司治療組及單純IL-15治療組相比，腫瘤體積也有所減小，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；盡管兩組治療方法均能縮小腫瘤體積，但依維莫司治療組與IL-15治療組之間的差異不具有

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2.依維莫司連續(xù)治療組較聯(lián)合用藥加依維莫司序貫治療組在第20天之前腫瘤體積稍小，IL-15治療加依維莫司序貫治療組較單純免疫治療組在第20天左右腫瘤增長有明顯下降趨勢，但長期并無明顯差別；依維莫司序貫治療組和聯(lián)合用藥加依維莫司序貫治療組腫瘤增長趨勢無明顯差別；聯(lián)合用藥組和單純依維莫司治療組腫瘤增長趨勢無明顯差別；聯(lián)合用藥組較單純免疫治療組腫瘤增長稍緩，但長期無明顯差別。
　　3.依維莫司治療

6、組和IL-15治療組均能有效地延長荷瘤動(dòng)物的生存時(shí)間，但其差異與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且兩治療組之間的差異也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而雙重治療組雖較對照組而言可延長造模動(dòng)物生存率，但與單純依維莫司和IL-15治療組相比，卻相對縮短造模動(dòng)物生存率，而差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　4.IL-15治療組，腫瘤組織中CD4、NKG2D表達(dá)較對照組及依維莫司治療組升高，CD8的表達(dá)較依維莫司治療組顯著

7、增加，Ki-67表達(dá)較對照組顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；依維莫司治療組，腫瘤組織中CD4、CD8、NKG2D的表達(dá)均較對照組及IL-15治療組降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ki-67的表達(dá)較對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而較IL-15治療組稍低，但差異并不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；雙重治療組CD4表達(dá)較對照組及依維莫司治療組增加，CD8表達(dá)較對照組及IL-15治療組降低，Ki-

8、67較對照組明顯降低，NKG2D表達(dá)較對照組及依維莫司治療組增加，而較IL-15治療組降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.IL-15能顯著提升CD16+細(xì)胞比例，與其余兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，能提升CD4+及CD8+T細(xì)胞比例，能降低CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞比例，但與對照組及依維莫司治療組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而依維莫司雖能降低CD4+、CD8+及CD16+細(xì)胞比例，增加CD25

9、+細(xì)胞比例，但與對照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　6.IL-15能顯著提升小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+及CD8+T細(xì)胞比例，降低CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞比例，與對照組及依維莫司治療組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；依維莫司能降低CD4+、CD8+、CD16+細(xì)胞比例，增加CD25+細(xì)胞比例，但與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　7.IL-15能提升小鼠肝淋巴細(xì)胞中CD16+細(xì)胞比例，與

10、對照組及依維莫司治療組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，能升高CD4+、CD8+細(xì)胞比例，降低CD25+細(xì)胞比例，與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；依維莫司能降低CD4+、CD8+、CD16+細(xì)胞比例，升高CD25+細(xì)胞比例，但與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　8.IL-15治療組和依維莫司治療組與對照組相比，腫瘤組織細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　研

11、究結(jié)論：
　　IL-15能夠通過調(diào)節(jié)患瘤小鼠的機(jī)體免疫細(xì)胞活性發(fā)揮其抗腫瘤活性，顯著延緩腫瘤的生長速度，調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡，延長荷瘤小鼠生存期。依維莫司作為mTOR抑制劑，對腫瘤細(xì)胞具有直接抑制作用，同樣能延緩腫瘤生長速度，有較強(qiáng)的促進(jìn)凋亡作用，延長荷瘤小鼠生存期。
　　IL-15免疫治療和依維莫司化學(xué)治療藥物機(jī)理以及治療靶點(diǎn)各不相同，但本研究中二者聯(lián)合應(yīng)用不產(chǎn)生協(xié)同作用，不增強(qiáng)抑瘤效果，可能與mTOR抑制劑對免疫系統(tǒng)直接發(fā)生