人細(xì)胞色素P450CYP2A13介導(dǎo)下姜黃素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:用不同濃度的姜黃素作用于肺腺癌A549空載體細(xì)胞株(A549CYP(-))和肺腺癌A549過(guò)表達(dá)株(A549CYP)，觀察姜黃素對(duì)A549CYP(-)和A549CYP細(xì)胞增殖的作用和周期的影響，檢測(cè)對(duì)細(xì)胞中Bax和Bcl-2基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平的影響。為探討姜黃素抗腫瘤的作用機(jī)制及潛在的臨床治療方案提供新的理論基礎(chǔ)。
　　方法:(1)MTT（四氮唑藍(lán)）法檢測(cè)A549CYP（-）與A549CYP生長(zhǎng)5天的吸光度值:取處于

2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組細(xì)胞，以2×103/孔接種于96孔板，每天各取3孔加入20μL(5mg/mL)MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后每孔加入DMSO200μL，使結(jié)晶充分溶解。連續(xù)5天觀察兩種細(xì)胞生長(zhǎng)情況。(2)MTT法檢測(cè)不同濃度姜黃素作用后A549CYP（-）與A549CYP細(xì)胞的生長(zhǎng)情況:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104/mL，每孔200μL。分別選取姜黃素終濃度為(0、5、10、

3、20、40)μg/mL的培養(yǎng)液作用于A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)后，采用MTT法檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處吸光度值。(3)分別用不同濃度的姜黃素(0、10、40)μg/mL的培養(yǎng)液作用于A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞48小時(shí)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)PI染色法檢測(cè)在不同條件作用下細(xì)胞的細(xì)胞周期變化情況。(4)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR

4、法檢測(cè)不同濃度的姜黃素(0、10、40)μg/mL的培養(yǎng)液作用于A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞48小時(shí)，細(xì)胞中Bax和Bcl-2基因表達(dá)水平的變化情況。(5)應(yīng)用蛋白質(zhì)印記(Western blot)技術(shù)檢測(cè)在不同姜黃素濃度(0、10、40)μg/mL干預(yù)48小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl-2的蛋白水平表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)MTT法檢測(cè)連續(xù)5天增殖的兩組細(xì)胞生長(zhǎng)情況顯示:兩組細(xì)胞增殖速率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.0

5、5)。(2)MTT法測(cè)定在不同濃度的姜黃素干預(yù)48小時(shí)后A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)情況顯示:①隨著濃度的增加姜黃素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制愈加明顯，兩對(duì)照組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②同一濃度不同細(xì)胞之間兩兩比較，差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(3)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況顯示:在不同濃度的姜黃素干預(yù)48小時(shí)后，A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞的細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞百分比

6、均隨著姜黃素濃度的升高而增加(P＜0.05)，不同細(xì)胞兩對(duì)照組之間相比升高不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);相同濃度之間實(shí)驗(yàn)組兩兩對(duì)比，A549CYP（-）細(xì)胞組比A549CYP細(xì)胞組G1期細(xì)胞百分比升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:①不同濃度的姜黃素作用于A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞中Bax基因的表達(dá)水平均上調(diào)，Bcl-2的基因表達(dá)水平均下調(diào)。②兩對(duì)照組之

7、間比較，Bax和Bcl-2的基因表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)組不同細(xì)胞同一藥濃度之間兩兩比較差異明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(5)姜黃素處理A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞48小時(shí)后，用Western blot技術(shù)檢測(cè)Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，經(jīng)姜黃素處理，對(duì)照組的兩種細(xì)胞Bax和Bcl-2的表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，隨著姜黃素濃度的增加，Bax的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)

8、下調(diào)，同一濃度不同細(xì)胞之間兩兩比較，Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平差異明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:①人肺腺癌A549CYP（-）和A549CYP這兩種細(xì)胞在沒(méi)有藥物干預(yù)的情況下，生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差別，CYP2A13基因并未對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響。②采用藥物姜黃素對(duì)人肺腺癌A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)48小時(shí)后發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)這兩種細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用，且對(duì)肺腺癌A549CYP（-）細(xì)