MLH1缺失的結(jié)直腸癌差異表達(dá)分子的篩選及其在化療抵抗中的作用.pdf

1、結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟、多途徑的過(guò)程，其中涉及多種癌基因、抑癌基因和錯(cuò)配修復(fù)基因(Mismatch Repair，MMR)的突變以及基因啟動(dòng)子的甲基化。MMR缺失是由于錯(cuò)配修復(fù)基因發(fā)生突變或啟動(dòng)子甲基化引起錯(cuò)配修復(fù)基因失活，造成機(jī)體錯(cuò)配修復(fù)功能降低，使某些癌基因和抑癌基因的突變?cè)隗w內(nèi)得到快速聚集，最終導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生?，F(xiàn)有的臨床的統(tǒng)計(jì)結(jié)果估計(jì)大約有15％～20％左右的結(jié)直腸癌患者存在著MMR的表達(dá)缺失。在散發(fā)性結(jié)直腸癌

2、中，MLH1(MutL homolog1)的缺失患者占MMR缺失的患者95％以上。
　　目前的臨床的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，MMR缺失導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中與腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫監(jiān)視、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及凋亡相關(guān)的分子產(chǎn)生突變。但這些發(fā)現(xiàn)都是在腫瘤組織樣本上統(tǒng)計(jì)分析得出。這些分子的突變或缺失是否由于MMR的缺失引起以及它們對(duì)于化療產(chǎn)生的影響都有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，構(gòu)建合適的MLH1缺失和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型，通過(guò)篩選MLH1表達(dá)改變后關(guān)鍵差異表達(dá)分子，探討這些

3、差異分子在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展以及化療治療中發(fā)揮的功能，是本課題的研究目的。
　　我們分別構(gòu)建了MLH1 shRNA穩(wěn)定干擾和過(guò)表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞模型，通過(guò)通量篩選檢測(cè)這兩個(gè)細(xì)胞模型中MLH1表達(dá)改變后引起的差異表達(dá)分子，發(fā)現(xiàn)MLH1可以調(diào)控下游分子DKK4(Dickkopf homolog4 protein)的表達(dá)。并在SW480，SW620及HT-29細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)干擾MLH1能誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)DKK4后，細(xì)胞對(duì)5-Fu的化療耐藥性增

4、強(qiáng)。此外在結(jié)直腸癌患者臨床組織樣本中驗(yàn)證MLH1與DKK4表達(dá)之間的聯(lián)系，并通過(guò)臨床回顧性分析MLH1與DKK4表達(dá)的關(guān)系及對(duì)結(jié)直腸癌患者化療治療及預(yù)后的影響。本課題通過(guò)以下三部分進(jìn)行研究。
　　第一部分:MLH1干擾和過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型中差異表達(dá)分子的篩選及鑒定:
　　1、MLH1干擾和過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型的建立:結(jié)直腸癌細(xì)胞中的MLH1的表達(dá)不同。我們通過(guò)Western-blot(WB)篩查了十種結(jié)直腸癌細(xì)胞株(購(gòu)自ATCC)ML

5、H1表達(dá)情況，確定采用MLH1表達(dá)正常的SW80細(xì)胞作為shRNA干擾模型， MLH1表達(dá)缺失的HCT-116作為過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型。
　　我們構(gòu)建了MLH1 shRNA干擾(Knock Down，KD)和過(guò)表達(dá)慢病毒載體。將MLH1 shRNA干擾序列和cDNA序列分別酶切插入至慢病毒干擾載體，通過(guò)Trans-EZ轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒的包裝，收集上清進(jìn)行干擾慢病毒的濃縮和純化，得到shRNA干擾的慢病毒和MLH1過(guò)表達(dá)慢病

6、毒的總滴度經(jīng)過(guò)Q-PCR驗(yàn)證都在108TU以上。
　　將包裝好的shRNA干擾的慢病毒感染SW480細(xì)胞株，通過(guò)嘌呤霉素的壓力篩選出陽(yáng)性的細(xì)胞克隆，WB檢測(cè)MLH1干擾效果較好的細(xì)胞株，結(jié)果顯示有效的干擾效果達(dá)到90％以上。選用干擾效果最好的克隆株(命名為SW480-MLH1KD)和轉(zhuǎn)入空病毒載體的對(duì)照株(命名為SW480-Ctr)進(jìn)行差異表達(dá)分子的分析。同時(shí)將包裝好的MLH1的過(guò)表達(dá)病毒感染HCT-116細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素的壓力

7、篩選出陽(yáng)性MLH1過(guò)表達(dá)克?。麨镠CT-116-MLH1）。
　　2、MLH1干擾和過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型中差異表達(dá)分子的篩選及鑒定:MMR缺失促使DNA突變產(chǎn)生積累，從而造成了腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生新的變異分子，我們采用雙向電泳串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析這些變異分子的氨基酸序列，從而檢測(cè)到這些差異表達(dá)的新分子。通過(guò)雙向電泳我們發(fā)現(xiàn)SW480-Ctr和SW480-MLH1KD細(xì)胞模型組中有10個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)差異顯著。質(zhì)譜檢測(cè)并分析成功的有未命名蛋白(un

8、namedprotein product)，延胡索酸酶前體(fumarate hydratase)，不均一核糖核蛋白H(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H)等。其中有3個(gè)為變異新分子unnamed protein，為尋找新的生物學(xué)標(biāo)志(biomarker)帶來(lái)希望。
　　Affymetrix公司的人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片Human Genome U133Plus2.0能檢測(cè)38

9、，500個(gè)明晰的人類基因，我們通過(guò)mRNA表達(dá)芯片檢測(cè)了SW480-Ctr和SW480-MLH1-KD細(xì)胞模型中差異分子，其中mRNA表達(dá)差別在2倍以上的差異表達(dá)基因共有334個(gè)。SW480-MLH1-KD細(xì)胞中表達(dá)顯著升高的分子有DKK4, SLC7A7, TNC, MAOA, TM4SF5, SYTL2, VIL1, NT5E, CST7,PRAP1等，而下調(diào)的分子有CXCL6和MUCLI1等。而DKK4，NT5E，MUCLI1和C

10、XCL6等分子與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展以及臨床治療密切相關(guān)。
　　接著通過(guò)雙向電泳檢測(cè)HCT-116-Ctr和HCT-116-MLH1細(xì)胞模型組中有7個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)差異顯著。其中MLH1過(guò)表達(dá)后上調(diào)的有6個(gè)分子，其中3個(gè)為變異新分子unnamed protein。下調(diào)表達(dá)的有1個(gè)分子為annexinA1。但未找出與SW480MLH1 KD細(xì)胞模型中變化一致的分子。
　　mRNA表達(dá)譜芯片分析HCT-116-Ctr和HCT-116-

11、MLH1細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)mRNA表達(dá)水平差別在2倍以上的差異表達(dá)基因共有424個(gè)。而我們感興趣的是在HCT-116-MLH1細(xì)胞中DKK4分子的表達(dá)下調(diào)，這與SW480-MLH1KD細(xì)胞模型中干擾MLH1能促進(jìn)DKK4的表達(dá)一致。
　　第二部分MLH1干擾與DKK4表達(dá)關(guān)系及對(duì)化療藥物作用的影響DKK4是Dickkopf家族蛋白的一種。目前發(fā)現(xiàn)的DKK家族蛋白有四種，分別為DKK1-DKK4，為225-350個(gè)氨基酸殘基組成的可分泌

12、蛋白。每種DKK分子都含有兩段富含半胱氨酸的的區(qū)域組成。DKK4被認(rèn)為是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的拮抗劑，而近年來(lái)DKK4的表達(dá)與結(jié)直腸癌化療抵抗的研究成為新的熱點(diǎn)。
　　我們首先檢測(cè)了SW480-MLH1KD細(xì)胞模型和HCT-116-MLH1細(xì)胞模型對(duì)于5-Fu的化療影響。體外通過(guò)不同濃度5-Fu的作用后，與空載體對(duì)照Ctr相比，干擾了MLH1表達(dá)的SW480-MLH1KD細(xì)胞死亡數(shù)目減少;而過(guò)表達(dá)MLH1的HCT-1

13、16-MLH1細(xì)胞死亡數(shù)目顯著增多，說(shuō)明MLH1缺失能引起腫瘤細(xì)胞對(duì)5-Fu的化療抵抗。
　　在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中MLH1缺失主要為啟動(dòng)區(qū)的甲基化而導(dǎo)致不表達(dá)，因此我們?cè)阱e(cuò)配修復(fù)功能正常的SW480，SW620和HT-29結(jié)直腸癌細(xì)胞模型中，通過(guò)shRNA慢病毒穩(wěn)定干擾MLH1表達(dá)，并隨機(jī)挑選了空載體對(duì)照Ctr和MLH1KD克隆株各4株，檢測(cè)MLH1 KD和DKK4表達(dá)之間的關(guān)系。SW480，SW620和HT-29 Ctr克隆

14、株幾乎不表達(dá)DKK4，而干擾MLH1的SW480，SW620和HT-29的MLH1KD細(xì)胞克隆中，隨著MLH1的表達(dá)抑制，多數(shù)克隆中的DKK4的在細(xì)胞內(nèi)mRNA水平和細(xì)胞上清的蛋白水平的表達(dá)都顯著上調(diào)，但各個(gè)克隆中的DKK4上調(diào)的表達(dá)量不同。三組細(xì)胞模型都充分證實(shí)了MLH1缺失后會(huì)上調(diào)其DKK4的表達(dá)。
　　為檢測(cè)MLH1缺失的腫瘤細(xì)胞是否是通過(guò)誘導(dǎo)DKK4表達(dá)產(chǎn)生對(duì)化療的抵抗，我們?cè)赟W480，SW620和HT-29 MLH1K

15、D細(xì)胞模型中選取了shRNA穩(wěn)定干擾MLH1后DKK4高表達(dá)(high)和DKK4低表達(dá)(low)的克隆株模型，檢測(cè)它們對(duì)化療藥物5-Fu，OXA及CPT的化療抵抗情況。結(jié)果顯示，在5-Fu的作用下，MLH1 KDDKK4 high克隆株的存活率都明顯高于MLH1 KD DKK4 low克隆株，而對(duì)OXA及CPT的作用后其存活率無(wú)影響。提示細(xì)胞MLH1干擾或缺失后引起DKK4的表達(dá)可能是其產(chǎn)生對(duì)5-Fu的化療抵制的重要因素。
　　

16、接著我們初步探討了MLH1通過(guò)何種機(jī)制調(diào)節(jié)下游DKK4的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)在SW480-MLH1KD的四個(gè)細(xì)胞克隆中，隨著MLH1的表達(dá)降低，細(xì)胞中的總的β-catenin的表達(dá)量也明顯降低，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路受到抑制，與促進(jìn)DKK4的表達(dá)密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TFAP2E能與DKK4的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合從而抑制DKK4的表達(dá)，我們檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)MLH1 KD后不能通過(guò)調(diào)控TFAP2E促進(jìn)DKK4的表達(dá)。
　

17、　第三部分:臨床回顧性分析MLH1與DKK4表達(dá)關(guān)系及對(duì)化療的影響:
　　前面兩部分我們通過(guò)多個(gè)細(xì)胞模型驗(yàn)證了干擾MLH1后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DKK4的表達(dá)上調(diào)，而且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中MLH1干擾或缺失后引起DKK4的表達(dá)是其產(chǎn)生對(duì)5-Fu的化療抵制的原因。本部分我們進(jìn)一步在臨床樣本中驗(yàn)證在細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果。
　　首先我們收集了271例結(jié)直腸癌患者組織切片，其中MLH1+DKK4+的患者為140例，MLH1+DKK4-的患者為86

18、例，MLH1-DKK4+的患者37例，而MLH1-DKK4-的患者僅有8例。MLH1缺失患者中DKK4陽(yáng)性患者比率高于DKK4陰性患者，提示MLH1缺失可能會(huì)影響DKK4的表達(dá)。這也驗(yàn)證了我們?cè)诩?xì)胞模型上觀察到的MLH1干擾后引起DKK4表達(dá)的現(xiàn)象，說(shuō)明MLH1干擾或缺失能夠伴隨著DKK4的表達(dá)。
　　隨后我們從271例結(jié)直腸癌患者組織切片中篩選了186例患者基本信息完整的切片標(biāo)本，檢測(cè)患者基本情況和MLH1表達(dá)之間的關(guān)系。MLH

19、1缺失的患者有32例占17％。分析MLH1表達(dá)與患者性別以及TNM分型之間的關(guān)系，結(jié)果顯示MLH1的表達(dá)情況與患者的與患者性別以及TNM分型之間的聯(lián)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;接著我們檢測(cè)了患者基本情況和DKK4表達(dá)之間的關(guān)系。DKK4+的患者共126例占68％，而DKK4-患者為60例占32％。結(jié)果同樣顯示DKK4的表達(dá)情況與患者的與患者性別以及TNM分型之間的聯(lián)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　最后我們分析組織樣本中表達(dá)MLH1和DKK4表達(dá)對(duì)患者總

20、生存期(Overallsurvival，OS)的關(guān)系。從271例結(jié)直腸癌患者組織切片中收集了176例以5-Fu為基礎(chǔ)化療治療CRC患者腫瘤組織標(biāo)本，約17％(30/176)的患者M(jìn)LH1表達(dá)缺失，截止隨訪結(jié)束累積死亡例數(shù)為13。我們發(fā)現(xiàn)與MLH1正常的患者相比，MLH1缺失的患者總生存期更低(P=0.0269)。提示MLH1缺失在以5-Fu為基礎(chǔ)化療治療CRC患者的預(yù)后中起重要作用，MLH1缺失患者預(yù)后較差;而DKK4表達(dá)陽(yáng)性的患者約為

21、62％(109/176)，截止隨訪結(jié)束累積死亡例數(shù)為40。我們發(fā)現(xiàn)與DKK4表達(dá)陰性的患者相比，DKK4表達(dá)陽(yáng)性的患者的總生存期更低(P=0.00154)。DKK4表達(dá)陽(yáng)性在以5-Fu為基礎(chǔ)化療治療CRC患者的預(yù)后中起重要作用，DKK4表達(dá)陽(yáng)性患者預(yù)后較差。
　　進(jìn)一步研究MLH1缺失患者中DKK4表達(dá)對(duì)患者的OS的影響，結(jié)果顯示MLH1缺失DKK4表達(dá)陽(yáng)性患者約占77％(23/30)，截止隨訪結(jié)束累積死亡例數(shù)為13;而MLH1缺

22、失DKK4表達(dá)陰性組，約占33％(7/30)，截止隨訪結(jié)束無(wú)死亡患者。我們發(fā)現(xiàn)MLH1缺失伴隨DKK4表達(dá)陽(yáng)性的患者的總生存期更低(P=0.01787)，平均生存時(shí)間為29.38(95％CI，27.09～31.66)，說(shuō)明在MLH1缺失的患者中，DKK4表達(dá)陽(yáng)性患者在以5-Fu為基礎(chǔ)化療治療CRC患者的預(yù)后中起重要作用，這類患者對(duì)化療的療效較差;而MLH1缺失DKK4表達(dá)陰性的患者的化療療效較好。
　　該結(jié)果提示MLH1缺失伴隨D