中性顆粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡相關(guān)miRNA的鑒定及功能研究.pdf

1、目的:中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)是人體重要的炎癥細(xì)胞，參與機(jī)體對(duì)病原微生物的防御，在人體非特異性免疫反應(yīng)起著重要的作用。中性粒細(xì)胞自骨髓釋放至外周血循環(huán)后其生命期限僅24～48 h，一旦進(jìn)入血液循環(huán)即啟動(dòng)自發(fā)性凋亡程序來維持其數(shù)量的平衡和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對(duì)炎癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸起著重要的作用。miRNA是一類非編碼小RNA，長(zhǎng)度約為18～24個(gè)核苷酸，它通過與靶mRNA的3'端非編碼區(qū)域

2、結(jié)合，降解mRNA或阻止mRNA的翻譯，發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。本研究通過檢測(cè)自發(fā)性凋亡進(jìn)程中中性粒細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA，探討miRNA在中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡過程中的作用，為中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡機(jī)制的研究提供新思路，也為炎癥性疾病的診斷及治療方法的選擇提供新的依據(jù)。
　　方法:(1)分離人外周靜脈血中性粒細(xì)胞，鑒定其活力與純度，并分組培養(yǎng)不同的時(shí)間。對(duì)照組:新鮮分離(0 h)中性粒細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)組:分離后分別培養(yǎng)12h和24 h的中性粒

3、細(xì)胞;(2)分別收集各組細(xì)胞并提取總RNA;(3)應(yīng)用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)(DGE)檢測(cè)和篩選0h和24 h中性粒細(xì)胞差異表達(dá)的mRNA，差異超過2倍為有意義結(jié)果;(4)應(yīng)用Affymetrix miRNA芯片檢測(cè)和篩選對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組差異表達(dá)的miRNA，差異超過2倍為有意義結(jié)果;(5)從篩選出的差異表達(dá)的miRNA中選取4個(gè)(miR-4419a、miR-487b、miR-4417、miR-432)進(jìn)行Northern Blot檢測(cè)，驗(yàn)證

4、芯片結(jié)果的可靠性;(6)對(duì)差異表達(dá)的miRNA應(yīng)用www.mirbase.org、www.targetscan.org和mirdb.org三個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，對(duì)三個(gè)數(shù)據(jù)庫的結(jié)果取交集;得到的結(jié)果再與DGE結(jié)果相結(jié)合，篩選二者的共同結(jié)果;(7)將從靶基因預(yù)測(cè)和DGE共同的結(jié)果中選取2個(gè)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因（PKCβ和MCL1），應(yīng)用RT-PCR和Western Blot進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，確定miRNA、相關(guān)靶基因與中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋

5、亡的相關(guān)性。
　　結(jié)果:(1) DGE共篩選出差異表達(dá)的基因1，317個(gè)，其中包含多個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因;(2) miRNA芯片結(jié)果:以0h組為對(duì)照，12h組表達(dá)上調(diào)的miRNA有21個(gè)，下調(diào)的有21個(gè)，24 h組表達(dá)上調(diào)的有41個(gè)，下調(diào)的有22個(gè)，其中12h和24 h組共同上調(diào)的有13個(gè)，共同下調(diào)的有11個(gè);(3) Northern Blot檢測(cè)miR-4419a、miR-432和miR-487b表達(dá)上調(diào)，miR-4417表達(dá)

6、下調(diào)，結(jié)果與芯片結(jié)果一致;(4)生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:PKCβ可能為miR-432和miR-199a的靶基因，MCL1可能為miR-4539的靶基因;(5) RT-PCR結(jié)果顯示:PKCβ表達(dá)降低，而其上游的miRNA(miR-432和miR-199a)表達(dá)升高，與DGE結(jié)果一致;MCL1表達(dá)降低，其上游的miRNA(miR-4539)表達(dá)升高，與DGE結(jié)果一致;(6) Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示PKCβ表達(dá)降低，MCL1表