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文檔簡介
1、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是成人最常見的原發(fā)性腦腫瘤,雖然以Stupp標(biāo)準(zhǔn)治療方法使膠質(zhì)瘤的療效有了明顯提高,但其5年生存率僅有9.8%。目前替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是膠質(zhì)瘤的特效化療藥物,使得新診斷的GBM中位生存期由12.1個月提高至14.6個月,但是由于內(nèi)源性和獲得性耐藥, TMZ化療作用仍不理想。膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(Glioma Initiating Cells,GIC
2、)是腫瘤中存在的一小部分細(xì)胞,這些細(xì)胞具有自我更新的能力,分化能力,腫瘤形成能力。這些細(xì)胞被認(rèn)為可能是腫瘤形成的根源,比其他分化的腫瘤細(xì)胞對放化療更加耐藥,是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的根源。因此,尋找增敏TMZ的藥物并探討化療耐藥的機(jī)制成為當(dāng)前迫切的任務(wù)。目前,有許多針對腫瘤化療耐藥的藥物研究,其中有發(fā)現(xiàn)中國的傳統(tǒng)藥物雷公藤甲素(triptolide,TPL)對多種腫瘤包括膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胃癌、膀胱癌等均有抗癌作用,其抗癌活性強(qiáng)。并有研究發(fā)現(xiàn)TPL
3、能增加多種化療藥物的敏感性。本研究擬探討雷公藤甲素是否能增敏替莫唑胺殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞及膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞,并探討其作用機(jī)制,揭示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對TMZ的化療耐藥的可能機(jī)制及雷公藤甲素的治療意義。
第一部分、雷公藤甲素增敏替莫唑胺殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞
目的:探討雷公藤甲素是否能增加替莫唑胺殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效應(yīng)及其可能機(jī)制。
方法:使用 CCK-8法測定 TPL與TMZ對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響;采用Chou–Talalay法評
4、估TPL與TMZ的聯(lián)合效應(yīng);分別應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期技術(shù)、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡技術(shù)與Western-blot技術(shù)檢測TPL與TMZ單藥或聯(lián)合作用于 U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞后的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
結(jié)果:TPL與TMZ作為單藥均能夠以劑量依賴性的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖;在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系與SKMG-1膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,TPL聯(lián)合TMZ抑制U87細(xì)胞與SKMG-1細(xì)胞達(dá)IC50時聯(lián)合指數(shù)(combination
5、 index,CI)分別為0.76與0.866,表明TPL與TMZ具有協(xié)同作用;TPL與TMZ聯(lián)合用藥后,U87細(xì)胞凋亡比例顯著高于單藥用藥組(p<0.05);TPL與TMZ聯(lián)合用藥后,NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中P-I-κBα以及抗凋亡蛋白XIAP的表達(dá)明顯下調(diào)。
結(jié)論:TPL可能通過抑制 NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化并進(jìn)一步誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡來增加TMZ對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
第二部分、雷公藤甲素增敏替莫唑胺殺傷膠
6、質(zhì)瘤起始細(xì)胞
目的:探討雷公藤甲素是否能增加替莫唑胺殺傷膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的效應(yīng)及其可能作用機(jī)制。
方法:使用CCK-8法測定TPL和TMZ對膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞殺傷作用的影響,根據(jù)Chou–Talalay法計算的CI評估TPL和TMZ的聯(lián)合作用,使用腫瘤球形成實驗測定藥物對膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的自我的更新作用的影響,使用流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)和western-blot技術(shù)檢測藥物對膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞凋亡作用的影響,使用雙熒光素酶報告基因檢
7、測系統(tǒng)檢測藥物對NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響,使用western-blot技術(shù)檢測藥物對NF-κB信號通路下游蛋白、P-P65和P-I-κBα、P65核蛋白表達(dá)的影響,動物實驗觀察藥物對小鼠生存期的影響。
結(jié)果:TPL與TMZ作為單藥均能夠以劑量依賴性的抑制膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞增殖,但是膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞對TMZ耐藥,我們測得 GSC-1與GSC-2的IC50分別為779.5umol/l和943.5umol/l。TPL能協(xié)同TMZ殺傷膠質(zhì)瘤
8、起始細(xì)胞,即能增強(qiáng)TMZ的殺傷作用又能減少TMZ的使用劑量。TPL聯(lián)合TMZ能顯著抑制膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的自我更新能力并誘導(dǎo)其凋亡。TPL聯(lián)合TMZ能顯著抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,并下調(diào)NF-κB信號通路下游蛋白、P65核蛋白、P-P65和P-I-κBα表達(dá)。在體內(nèi)實驗中,TPL聯(lián)合TMZ用藥后,小鼠遠(yuǎn)期生存時間較單獨用藥組顯著延長。
結(jié)論:TPL能協(xié)同TMZ殺傷膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞,其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB信號通路的活化并進(jìn)
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