沙利度胺與替莫唑胺抑制膠質(zhì)瘤細胞黏附、侵襲以及整合素表達機制的研究.pdf

1、背景與目的：膠質(zhì)母細胞瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，是星形細胞腫瘤中侵襲能力最強的類型，膠質(zhì)母細胞瘤患者預后很差，即使給予手術治療并輔以放療和化療，病人的中位生存期仍然小于1年。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是一種新型二代口服烷化劑，對膠質(zhì)母細胞瘤有顯著的抗腫瘤作用，沙利度胺(thalidomide，THD)是一種谷氨酸衍生物，其具體作用機制尚不完全清楚，一般認為THD可通過抑制整合素αvβ3、αvβ5的表達以及血管內(nèi)皮生長因

2、子等介導的生血管作用來抑制腫瘤細胞對間質(zhì)的黏附與血管生成。THD能增強TMZ對惡性膠質(zhì)瘤的治療作用。本實驗主要研究THD、TMZ以及THD與TMZ聯(lián)合應用對膠質(zhì)瘤細胞αvβ3整合素受體表達、黏附、遷移與侵襲的影響，進而探討THD增強TMZ對惡性膠質(zhì)瘤治療作用的潛在機理。 方法： ①制備膠質(zhì)瘤來源的細胞外基質(zhì)，并在鋪被有細胞外基質(zhì)的培養(yǎng)皿中分別以加入THD(100μg/ml)、TMZ(100μM)以及THD+TMZ(100

3、μg/ml+100μM)的培養(yǎng)液培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細胞系LN229細胞，對照組加入等體積溶媒(DMSO)。在倒置顯微鏡下觀察細胞的貼壁過程及形態(tài)變化。 ②檢測各組LN229細胞表達整合素αvβ3的陽性率和平均熒光強度(meanfluorescence intensities，MFI)首先用磺酰羅丹明B(SRB)比色法分別測定各組懸浮細胞的存活率。各組細胞培養(yǎng)4h后取懸浮細胞，并用0.25％胰酶消化貼壁細胞，充分懸浮細胞。取細胞(1×1

4、04)200g離心5min，棄上清。用含1％牛血清白蛋白的PBS洗滌2遍后加異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人整合素αvβ3抗體及其同型對照，于4℃孵育45min，PBS再次洗滌，用流式細胞儀檢測。獲得陽性細胞比例以及MFI值。 ③檢測各組細胞黏附于細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的能力將LN229細胞以5×104/ml的密度接種于鋪被有同種細胞來源的ECM的96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基內(nèi)含有THD、T

5、MZ、THD+TMZ以及等量溶媒，培養(yǎng)60分鐘。輕輕吸出細胞懸液，用預溫的PBS洗三次，除去未黏附細胞。每孔加入10％戊二醛100μl固定30分鐘，0.1％結(jié)晶紫染色細胞后在酶標儀上測定595 nm波長處的光密度(OD)值。 ④評價各組LN229細胞侵襲與遷移能力建立Transwell小室模型與劃痕損傷模型，觀察各組體外培養(yǎng)的LN229膠質(zhì)瘤細胞穿過基質(zhì)膠的數(shù)量與細胞遷移的距離，并以此反映各組藥物對細胞侵襲與遷移能力的影響。

6、 結(jié)果： ①溶媒對照組與TMZ單藥組大多數(shù)LN229細胞迅速形成偽足并與其他細胞接觸形成單細胞層。THD和TMZ聯(lián)合組有大量LN229細胞呈游離狀態(tài)，貼壁細胞的偽足短仍保持類圓形。 ②THD與TMZ對細胞整合素αvβ3表達的影響 SRB法檢測懸浮細胞的存活率，對照組及TMZ組懸浮細胞很少，故忽略不計。THD組懸浮細胞OD值為0.216，聯(lián)合組懸浮細胞OD值為0.209，兩組懸浮細胞生存率分別為93.5％，90.5％。

7、各組懸浮細胞生存率都在90％以上。 流式細胞計檢測顯示THD組和聯(lián)合組LN229整合素αvβ3表達減弱，其中貼壁細胞整合素αvβ3的陽性表達率分別為對照組的81.8％與77.9％，平均熒光強度(MFI)分別為對照組的66.8％、53.7％；懸浮細胞整合素αvβ3陽性表達率更低，分別為對照組的63.7％、55.0％，MFI分別為對照組的49.8％、54.1％。而TMZ組αvβ3陽性表達率為對照組的103.3％，MFI為對照組的90

8、.4％。 ③THD與TMZ對LN229細胞黏附于細胞外基質(zhì)的作用：THD組與聯(lián)合組培養(yǎng)皿孔內(nèi)剩余的結(jié)晶紫染色的細胞明顯少于對照組和TMZ組(P均<0.05)，THD組與聯(lián)合組之間無差別，TMZ組與對照組間也無差異(P>0.05)。THD，TMZ，THD+TMZ組細胞黏附抑制率分別為25.23％、0.88％、26.83％。 ④THD與TMZ對LN229細胞侵襲及遷移能力的影響侵襲實驗中THD組與THD+TMZ組平均每視野侵

9、襲細胞數(shù)目小于TMZ組與對照組(P均<0.05)，但THD組與聯(lián)合組兩組間無差異(P>0.05)。細胞劃痕試驗中THD組與THD+TMZ組細胞與對照組相比遷移距離縮短(P<0.05)，THD組與聯(lián)合組間無差異(P>0.05)。TMZ組對照組間無差異(P>0.05)。 結(jié)論：THD具有影響細胞黏附于ECM的能力以及抑制細胞遷移與侵襲能力的作用，其機制可能與抑制或干擾膠質(zhì)瘤細胞αvβ3整合素受體的表達有關。替莫唑胺對膠質(zhì)瘤細胞αvβ