CD11clowCD45RBhigh調(diào)節(jié)性DC對異基因骨髓移植小鼠GVHD和GVL的作用.pdf

1、目的：建立急性單核細(xì)胞白血病小鼠(AMOL)模型，觀察CD11clowCD45RBhigh表型的調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞(DCreg)對異基因骨髓移植(allo-BMT)小鼠移植物抗宿主病(GVHD)及移植物抗白血病(GVL)的調(diào)控作用，為GVHD的防治提供實驗依據(jù)。
　　方法：1、無菌條件下取C57BL/6小鼠的骨髓單個核細(xì)胞(MNC)，均勻接種至含有RPMI1640完全培養(yǎng)基的六孔板中，按組別分別加入不同的細(xì)胞因子，培養(yǎng)不同種類的樹突

2、狀細(xì)胞(DC)。實驗分為3組:①DCreg組:用含rmGM-CSF20ng/mL、IL-1020 ng/mL，TGF-β120 ng/mL的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激24 h使其成熟。②成熟樹突狀細(xì)胞(mDC)組，用含rmGM-CSF20 ng/mL、rm-IL-410 ng/mL的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)6d，予LPS刺激24 h，使其成熟。③未成熟DC組(imDC)，用含rmGM-CSF20 ng/m

3、L、rmlL-410 ng/mL的RPMI1640培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)7d。用倒置顯微鏡及透射電鏡觀察DC的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞術(shù)鑒定其免疫表型;CCK-8法檢測上述不同種類DC刺激異基因淋巴細(xì)胞增殖能力;趨化實驗檢測細(xì)胞遷移能力。2、建立白血病骨髓移植小鼠模型:以C57BL/6小鼠為供鼠，BALB/c小鼠為受鼠，BALB/c小鼠經(jīng)致死劑量60Coγ射線全身照射(TBI)后4h內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸注AMOL細(xì)胞株SHI-1細(xì)胞、供鼠骨髓MNC和

4、脾臟MNC。實驗分為5組:TBI組(n=5);AMOL組(n=10):即輸注同基因小鼠骨髓MNC5×106/只和脾臟MNC5×105/只，同時輸注SHI-1細(xì)胞1.2×107/只;allo-BMT組(n=15):即輸注異基因小鼠骨髓MNC5×106/只和脾臟MNC5×105/只，同時輸注SHI-1細(xì)胞1.2×107/只;imDC移植組(n=15):在allo-BMT的基礎(chǔ)上輸注imDC5×106/只;DCreg移植組(n=15):在al

5、lo-BMT的基礎(chǔ)上輸注DCreg5×106/只。通過受鼠GVHD臨床評分、病理評分、異基因嵌合體、生存期等，觀察輸注DCreg、imDC對移植小鼠GVHD的影響，并通過白血病發(fā)生率、生存期評價GVL效應(yīng)。
　　結(jié)果：1.DC細(xì)胞的鑒定:①倒置顯微鏡下觀察小鼠骨髓MNC培養(yǎng)24 h后大部分貼壁生長，僅見少量懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)3d左右，可見細(xì)胞呈現(xiàn)“葡萄”狀生長的集落，培養(yǎng)至4d后可見細(xì)胞表面出現(xiàn)不規(guī)則樹突狀突起，呈現(xiàn)典型的DC形態(tài)，集

6、落邊緣也可見毛刺狀突起，約5d時細(xì)胞逐漸從集落中釋放出來，并懸浮生長;②透射電鏡下觀察到mDC放射狀突起多而密集，細(xì)胞表面褶皺多;imDC、DCreg放射狀突起較稀疏，細(xì)胞表面褶皺減少;③mDC高表達(dá)CD80、CD86、CD11c和IA/IE分子，imDC低表達(dá)CD80、CD86、IA/IE分子，高表達(dá)CD11c，與imDC相比DCreg高表達(dá)CD45RB，低表達(dá)CD11c及更低水平表達(dá)CD80、CD86。④DCreg組、imDC組增殖

7、率明顯低于mDC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而DCreg組增殖率最低(P＜0.05)。⑤DCreg組、imDC組遷移能力強于mDC組，(P＜0.05)，而DCreg組遷移能力最強（P＜0.05）。
　　2.DCreg對allo-BMT小鼠GVHD和GVL的影響:①白血病小鼠發(fā)病情況:AMOL組小鼠+25 d左右可見白血病細(xì)胞浸潤眼球，28d內(nèi)全部死亡，死亡原因為白血病，解剖小鼠可見肝脾明顯腫大，肝臟散在白血病浸潤病灶，組

8、織病理學(xué)檢查提示肝、脾、肺有白血病細(xì)胞浸潤。②融合基因的檢測:取AMOL組瀕死的小鼠脾臟及肝臟組織檢測其融合基因，最早于21d可檢測出MLL/AF6;③嵌合體的檢測:骨髓移植+18d，取allo-BMT組存活受鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)FCM檢測嵌合體，H-2d陽性細(xì)胞占96.8％，提示完全嵌合;④DCreg組小鼠GVHD臨床評分(3.8±0.68)，較allo-BMT組(7.6±0.99)、imDC組(4.93±0.96)均減低（P＜0.05）。⑤

9、DCreg組小鼠GVHD靶器官肝、小腸、肺病理損傷程度均較輕，病理評分均較低(P＜0.05);⑥AMOL組小鼠白血病發(fā)病率為100％，allo-BMT組、imDC組及DCreg組小鼠白血病發(fā)病率40％、20％、10％，各組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）⑦小鼠存活情況:DCreg組小鼠+8 d開始死亡，+40 d有20％的小鼠存活，較allo-BMT組、imDC組受鼠均延長(P＜0.05)。
　　結(jié)論：1、應(yīng)用細(xì)胞因子GM-CSF