甘藍(lán)型油菜中可能與ATP 6相互作用的基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)雄性不育和核控制的育性恢復(fù)是廣泛存在于植物中的生理現(xiàn)象。細(xì)胞質(zhì)雄性不育不僅是研究細(xì)胞核基因和細(xì)胞質(zhì)基因相互作用的的重要材料，而且該現(xiàn)象在雜種優(yōu)勢的利用中有著十分重要的作用。因此，研究哪些與細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)的基因，利用基因工程的方法創(chuàng)造雄性不育系，在雜交中的生產(chǎn)中具有重要的意義。 甘藍(lán)型油菜是世界上廣泛種植一種重要的油料作物，其雜種優(yōu)勢比較明顯，因此把雄性不育應(yīng)用于雜交種的生產(chǎn)具有重大的意義。目前，人們對于甘藍(lán)型油菜雄性不

2、育的研究主要集中于蘿卜胞質(zhì)不育，波里馬胞質(zhì)不育和nap胞質(zhì)不育。波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育因其不育性穩(wěn)定，容易找到恢復(fù)基因，此不育系被認(rèn)為在雜交中的生產(chǎn)中是最有優(yōu)勢的。 甘藍(lán)型油菜波利馬(Brassica napus pol．)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系因其不育性穩(wěn)定，容易找到恢復(fù)基因，被認(rèn)為是一種很有實用價值的油菜胞質(zhì)不育類型。目前關(guān)于其分子機(jī)制的研究已證實，線粒體ATP合成酶的一個亞基ATP 6與其雄性不育相關(guān)。 以與甘藍(lán)型油菜波里

3、馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)的atp 6基因編碼的ATP 6作為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交技術(shù)，篩選與其相互作用的蛋白質(zhì)，并克隆出其編碼序列。 本試驗對其中的一個篩選結(jié)果進(jìn)行研究。測序結(jié)果表明，由酵母雙雜交所篩選到的序列只是基因的3’端序列，并不是基因的完整序列。在此已知片段的基礎(chǔ)上，我們利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)的方法對基因的5'端cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，測序后blast的比對結(jié)果表明，只是基因的部分序列，并沒有擴(kuò)增到基因全長序列。

4、根據(jù)RACE的測序結(jié)果，設(shè)計引物，通過染色體步移的方法進(jìn)行基因的克隆。測序后，將酵母雙雜交的測序結(jié)果，RACE的測序結(jié)果，以及染色體步移的測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，根據(jù)拼接所得到的全長序列設(shè)計引物：359-Up-primer： 5'-ATG ATG GAT ACT TTC CCT CCT TCG-3'：359-Down-primer.5'-TCA CCA GAA GGG TAA CAA AAC ACA AG-3'，分別以油菜的總基因組DNA

5、和反轉(zhuǎn)的cDNA作為模板，進(jìn)行基因全長的擴(kuò)增，連接到pMD18-T載體。測序結(jié)果分析表明，此基因的DNA全長為1172bp，cDNA全長為1011bp，內(nèi)含子長161bp，分為兩段序列，其長度分別為79bp和82bp。在NCBI上進(jìn)行比對分析，此基因含有水解酶家族十七的保守結(jié)構(gòu)域，該基因與擬南芥的編碼未知蛋白的基因(GeneBank登錄號為AA042272.1)同源性達(dá)88％，與擬南芥的推定的葡聚糖內(nèi)切-1，3-beta-葡萄糖酶1前體

6、(GeneBank登錄號為065539)的同源性為88％。利用網(wǎng)站和多種生物學(xué)軟件對推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行分析。分析結(jié)果表明，此氨基酸序列有以下特征：(1)無信號肽序列：(2)有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域。 由于在油菜中還未見有此基因序列的報道，其在油菜中的功能也是未知的。因此對該基因進(jìn)行了載體的構(gòu)建。先用Pst Ⅰ/BamH Ⅰ酶切含有目標(biāo)序列的T載體，連接到pBlueseript SK Ⅱ中間載體上面，再分別用EcoR V/BamH Ⅰ