5,7-二甲氧基白楊素對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響.pdf

1、目的:觀察5,7-二甲氧基白楊素(5,7-dimethoxychrysin,dMChR)抑制體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡作用并初步探討其抗肝癌作用機(jī)制,為尋找具有開發(fā)前景的肝癌治療活性新化學(xué)實(shí)體提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法: MTT比色法測(cè)定dMChR對(duì)體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞和人胚肝L-02細(xì)胞增殖活性的影響,評(píng)價(jià)其對(duì)人肝癌細(xì)胞作用選擇性;細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察活細(xì)胞及死細(xì)胞數(shù),計(jì)算細(xì)胞存活率,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,評(píng)

2、價(jià)dMChR對(duì) HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用;PI染色流式細(xì)胞計(jì)定量分析(FCM)法檢測(cè)dMChR誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡程度;AO/EB染色法熒光顯微鏡觀察dMChR誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變;應(yīng)用Western blot檢測(cè)dMChR對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PPARγ、PTEN、p-AKt、Caspase-3表達(dá)和活性的影響。
　　結(jié)果:MTT比色法結(jié)果顯示,以濃度為1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μM

3、的dMChR分別處理人肝癌HepG2細(xì)胞48小時(shí),其IC50值為3.22μM,其中16.0μM的dMChR作用HepG2細(xì)胞48小時(shí)的相對(duì)抑制率達(dá)79.59％,而相應(yīng)濃度的ChR和5-FU的抑制率分別為35.28%和74.01%,證明dMChR的對(duì)HepG2細(xì)胞的作用強(qiáng)于其ChR,而與5-FU近似。以同樣的濃度處理正常人胚肝(L-02)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn),其對(duì)正常人胚肝(L-02)細(xì)胞的IC50值為67.68μM,提示dMChR對(duì)正常人胚肝細(xì)胞

4、的增殖活性抑制作用弱于其對(duì)人肝癌(HepG2)細(xì)胞的抑制作用,對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖活性抑制作用選擇指數(shù)達(dá)21.03;而5-FU對(duì)正常人胚肝細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞的IC50值分別為11.94μM和4.93μM。說(shuō)明dMChR對(duì)人肝癌細(xì)胞具有較5-FU更強(qiáng)的相對(duì)選擇性作用。
　　細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示:不同濃度的dMChR,5-FU和ChR均對(duì)體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)作用,呈劑量依賴性,其作用效價(jià)高于ChR(P﹤0.05),而與5-FU類

5、似。以同樣的濃度處理正常人胚肝(L-02)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn),dMChR和ChR對(duì)L-02細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用均較5-FU弱。用終濃度為4.0μM的dMChR,5-FU和ChR連續(xù)作用4天,繪制生長(zhǎng)曲線。發(fā)現(xiàn)dMChR(4.0μM)顯著抑制人肝癌(HepG2)細(xì)胞的生長(zhǎng),呈時(shí)間依賴性,其抑制作用強(qiáng)于先導(dǎo)化合物ChR,而與5-FU相似;而對(duì)正常人胚肝(L-02)細(xì)胞抑制作用較5-FU弱。4.0μM的dMChR可使HepG2細(xì)胞群體倍增時(shí)間由正常的20

6、.51h延長(zhǎng)至29.72h。
　　PI染色FCM分析顯示,1.0μM,4.0μM,16.0μM的dMChR分別處理48小時(shí),HepG2細(xì)胞凋亡率分別為4.79%,11.5%,31.5%,呈濃度依賴性。dMChR(16.0μM)誘導(dǎo)凋亡率顯著高于相同濃度ChR的凋亡率(15.2%),而與相同濃度陽(yáng)性藥物5-FU相近(凋亡率為32.4%)。當(dāng)以1.0μM,4.0μM,16.0μM的dMChR處理HepG2細(xì)胞48h后,與正常對(duì)照組比較

7、,AO/EB染色熒光顯微鏡下見不同程度胞質(zhì)、核呈桔紅色,核形態(tài)基本正常的早期凋亡細(xì)胞和胞質(zhì)、核呈紅色,核皺縮或碎裂的晚期凋亡細(xì)胞。其中dMChR(16.0μM)處理組凋亡指數(shù)達(dá)32.70±0.92%,顯著高于相應(yīng)濃度先導(dǎo)化合物ChR組(16.17±0.42%)。
　　Western blot分析結(jié)果表明:經(jīng)1.0,4.0,16.0μM的dMChR處理24h后,與正常對(duì)照組相比,PPARγ蛋白和PTEN蛋白表達(dá)分別上調(diào)了1.8%,7

8、.47%,15.23%和1.73%,4.7%,13.23%;p-AKt表達(dá)分別較對(duì)照組下調(diào)了6.9%,9.83%和15.4%;caspase-3表達(dá)分別上調(diào)0.27%,4.83%,5.87%。證明dMChR誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡作用至少部分依賴于PPARγ的活化。
　　結(jié)論:
　　1、dMChR抑制HepG2細(xì)胞增殖活性作用強(qiáng),對(duì)人胚肝L-02細(xì)胞增殖活性抑制作用弱,其抑制HepG2細(xì)胞增殖活性作用具有相對(duì)選擇性。