不同劑量地塞米松對下丘腦神經(jīng)元凋亡影響的體外研究.pdf

1、危重癥相關(guān)皮質(zhì)醇不足（critical illness-related corticosteroid insufficiency，CIRCI），是指危重癥患者循環(huán)血糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)不足及組織細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素抵抗，即糖皮質(zhì)激素的絕對和相對不足。CIRCI作為危重疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥，導(dǎo)致患者預(yù)后不良及死亡率增加。研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，H

2、PA)軸功能失調(diào)在CIRCI的發(fā)生中起了重要作用。創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)患者經(jīng)常伴發(fā)HPA軸功能障礙，在中、重型TBI患者急性期HPA軸功能障礙的發(fā)生率均高于60％。我們的前期組織切片研究發(fā)現(xiàn)，大劑量糖皮質(zhì)激素明顯增加TBI大鼠的下丘腦神經(jīng)元凋亡，從而增加CIRCI發(fā)生率，導(dǎo)致了大鼠的死亡率增加，但不同劑量糖皮質(zhì)激素對下丘腦神經(jīng)元的確切作用機(jī)制不明。
　　目的:本實驗將進(jìn)一步研究不同劑

3、量糖皮質(zhì)激素對下丘腦神經(jīng)元凋亡的影響。探明不同劑量糖皮質(zhì)激素在不同的作用時間下對下丘腦神經(jīng)元活力及細(xì)胞形態(tài)的影響。進(jìn)一步探明大劑量糖皮質(zhì)激素加重TBI患者HPA軸功能損害及CIRCI發(fā)生率增加的機(jī)制。為臨床開展早期小劑量糖皮質(zhì)激素持續(xù)補(bǔ)充治療TBI合并HPA軸功能損害及CIRCI提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:采用不同劑量地塞米松（dexamethasone，DXM）持續(xù)作用于原代培養(yǎng)大鼠下丘腦神經(jīng)元，利用MTT技術(shù)檢測下丘腦神經(jīng)元活性

4、，確定出對神經(jīng)元活性抑制明顯的大劑量組及抑制不明顯的小劑量組。把神經(jīng)元分為大劑量GCs作用組、小劑量GCs作用組及對照組，三組神經(jīng)元分別行時間依賴MTT檢測，Annexin-Ⅴ/PI染色，western blot凋亡檢測(Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3)。利用我們?nèi)聵?gòu)建的適于神經(jīng)元復(fù)雜結(jié)構(gòu)研究的非接觸式、高分辨率的跳躍探針式離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)(hopping probe ion conductance microscop

5、y，HPICM)對三組體外培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元進(jìn)行連續(xù)掃描觀測細(xì)胞形態(tài)變化。
　　結(jié)果:MTT結(jié)果顯示地塞米松可劑量、時間依賴地抑制下丘腦神經(jīng)元活力。我們選擇10-5mol/L地塞米松為大劑量GCs作用組，以10-7mol/L地塞米松為小劑量GCs作用組。Annexin-Ⅴ/PI染色顯示，大劑量GCs組神經(jīng)元于應(yīng)用激素24h后細(xì)胞凋亡明顯增加，而小劑量GCs組與對照組相比沒有明顯變化。同時western blot檢測顯示大劑量GCs

6、組神經(jīng)元促凋亡蛋白激活型caspase-3及Bax明顯增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯減少。對體外培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元的HPICM連續(xù)掃描三維拓?fù)涑上耧@示，大劑量GCs組神經(jīng)元在12h后出現(xiàn)細(xì)胞凋亡表現(xiàn)，包括神經(jīng)突起串珠樣改變，神經(jīng)元胞體出現(xiàn)凋亡小體等細(xì)胞形態(tài)改變。同時通過細(xì)胞形態(tài)參數(shù)分析顯示:在大劑量GCs作用18h后下丘腦神經(jīng)元胞體平面積與體積明顯減少，神經(jīng)元胞體膜表面粗糙度(roughness of membrane surfac

7、e，RMS)在掃描12h后開始增加，這些形態(tài)變化顯示細(xì)胞發(fā)生了體積皺縮的細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:本課題研究為指導(dǎo)糖皮質(zhì)激素在TBI中的臨床應(yīng)用提供了參考。大劑量地塞米松可明顯促進(jìn)神經(jīng)元凋亡，從而對HPA軸產(chǎn)生直接的影響，增加患者的CIRCI發(fā)生率和不良預(yù)后，因此在臨床上應(yīng)避免早期大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊治療腦外傷患者。而小劑量糖皮質(zhì)激素沒有明顯增加下丘腦神經(jīng)元的凋亡，而中重型腦外傷患者很多合并HPA軸功能障礙，因此應(yīng)用小劑量糖皮質(zhì)激素補(bǔ)