PPFP基因轉(zhuǎn)染對(duì)人正常甲狀腺細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文PPFP基因轉(zhuǎn)染對(duì)人正常甲狀腺細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及蛋白質(zhì)組學(xué)研究姓名：劉劍鳴申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：王志明20100501博上學(xué)位論文 中文摘要?？寺∧０錚 E G F P ．C 1 ．P P F P 中，利用P C R 方法調(diào)取目的基因P P F P ，將該基因克隆到慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒p G C ．F U ( 含F(xiàn) l a g 基因) 中，得到重組的p G C ．F U ．P P F P ，通過(guò)P

2、 C R 、測(cè)序和分析比對(duì)驗(yàn)證P P F P 基因后，將p G C ．F U —P P F P 質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒p H e l p e r l ．0 、p H e l p e r 2 ．0 共同轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細(xì)胞株2 9 3 T 細(xì)胞，獲得攜帶P P F P 基因的重組慢病毒，收集并濃縮病毒上清液，測(cè)定重組慢病毒的滴度。再以攜帶P P F P 基因的重組慢病毒感染目的細(xì)胞S V 4 0 大T 抗原永生化人正常甲狀腺細(xì)胞系N t h y

3、—o r i 3 ．1 ，觀察感染效率。選擇感染效率滿意的細(xì)胞通過(guò)R T —P C R 和W e s t e r n b l o t 多次檢測(cè)P P F P 的表達(dá)，以確定P P F P基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立。結(jié)果：( 1 ) P C R 方法成功獲得目的基因片段P A X 8 ．1 ．7 ，P A X 8 ．9及P P A I q ．1 ．6 ，并成功將P A X 8 和P P A I Ⅵ拼接，構(gòu)建了P A X 8 與P P A R

4、 y 的融合基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒p E G F P ．C l —P A X 8 ／P P A R y 。( 2 ) 以重組真核表達(dá)質(zhì)粒p E G F P ．C 1 ．P A X 8 ／P P A R y 為模板，P C R方法成功獲得目的基因P P F P ，并成功構(gòu)建P P F P 基因的重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒p G C ．F U ．P P F P ，以該質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染2 9 3 T 細(xì)胞，成功獲得攜帶P P F P 基因的高滴度

5、的重組慢病毒，病毒滴度達(dá)3 ．5x 1 07 T U ／m L 。( 3 ) 以攜帶P P F P 基因的重組慢病毒和空白慢病毒分別感染人正常甲狀腺細(xì)胞N t h v ．耐3 ．1 ，感染效率高，大于9 0 ％，以R T —P C R 和W e s t e r n b l o t 檢測(cè)證實(shí)P P F P 基因在m R N A 和蛋白水平順利表達(dá)，P P F P 基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株成功建立，為進(jìn)一步研究P P F P基因的功能及其作用機(jī)制

6、奠定了基礎(chǔ)。結(jié)論：( 1 ) 成功克隆了人P A X 8 與P P A R y 的融合基因( P P F P基因) ，并構(gòu)建了P P F P 基因的重組慢病毒載體；( 2 ) 慢病毒載體是理想的基因轉(zhuǎn)移載體，可以高效的將P P F P 基因轉(zhuǎn)染至人正常甲狀腺細(xì)胞N t h y ．o r i 3 。1 ，轉(zhuǎn)染后P P F P 基因可持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。第二章P P F P 基因促進(jìn)人正常甲狀腺細(xì)胞N t h y ．o r i3 一l 增殖和迂徙

7、運(yùn)動(dòng)能力的體外實(shí)驗(yàn)研究目的：探討P P F P 基因轉(zhuǎn)染對(duì)人正常甲狀腺細(xì)胞N t h y ．o r i 3 ．1 生物學(xué)特性的影響，以明確P P F P 基因在F T C 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。方法：以P P F P 基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株N t h y ．o r i3 ．1 P P F P 、空白慢病毒感染細(xì)胞株N t h y ．o r i 3 ．1v e c 附以及未感染細(xì)胞株N t h y ．o r i3 ．1 為研究對(duì)象，通過(guò)M T