2-脫氧-D-葡萄糖對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和血管瘤生長的抑制作用.pdf

1、研究背景：
　　血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤,約60％位于頭頸部,大多位置表淺,嚴(yán)重地影響美觀,給患者帶來巨大的心理壓力。位于特殊部位的血管瘤可因出血、潰瘍、感染或壓迫等影響患者的生理功能,甚至危及生命。迄今對血管瘤的確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚,臨床上缺乏針對所有類型血管瘤的高效防治方法。因此研究出一種血管瘤的特效治療方法有非常重要的臨床意義。
　　2-脫氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)是一種葡萄糖

2、類似物,它可以通過抑制糖酵解途徑、N-連接糖基化途徑及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用來影響細(xì)胞生長的多個環(huán)節(jié),2-DG聯(lián)合其它抗腫瘤治療的方法可使療效更加顯著。
　　實驗?zāi)康模?br>　　本課題通過體內(nèi)、體外兩部分實驗的觀察,對2-DG治療嬰幼兒血管瘤的作用進(jìn)行初步探索,通過觀察2-DG在體外對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管及細(xì)胞凋亡的影響,研究2-DG對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)作用;通過觀察2-DG在體內(nèi)對移植瘤體積及細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的

3、影響,研究2-DG在體內(nèi)對血管瘤生長的作用,為臨床上血管瘤的治療探索新的途徑。
　　實驗方法：
　　1.MTT比色實驗。將HUVECs接種于96孔板,加入含0mM、0.06mM、0.6mM、6mM、9mM2-DG的ECM,檢測第二天、第三天和第四天各組的吸光度值。
　　2.倒置顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)實驗。將HUVECs接種于六孔板,加入含0mM、0.06mM、0.6mM、6mM、9mM2-DG的ECM,分別于0h、24h、4

4、8h觀察細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)變化。
　　3.體外劃痕實驗。將HUVECs接種于六孔板,加入20μL絲裂霉素C,劃痕,再加入含0mM、0.06mM、0.6mM、6mM、9mM2-DG的ECM,分別于0h、12h用倒置顯微鏡觀察并拍照。
　　4.Matrigel成管實驗。將50μLMatrigel平鋪于96孔板,接種HUVECs,再加入含0mM、0.06mM、0.6mM、6mM、9mM2-DG的ECM,分別于0h、12h用倒置顯微鏡拍

5、照并觀察。
　　5.流式細(xì)胞實驗。將HUVECs接種于六孔板,加入含0mM、0.06mM、0.6mM、6mM、9mM2-DG的ECM,24h后進(jìn)行預(yù)處理,再加入5μL FITC Annexin V、5μL PI及400μL Bing Buffer,用流式細(xì)胞儀檢測并分析。
　　6.構(gòu)建裸鼠血管瘤模型。將切成0.8cm×0.6cm×0.6 cm的瘤體小塊移植于裸鼠左、右腰背部皮下,于瘤體離體后1小時內(nèi)完成。
　　7.測量

6、瘤體體積。給藥后每隔兩天用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的體積,并繪制瘤體生長曲線。
　　8.病理組織學(xué)觀察。給藥后第35天取出移植瘤,10%甲醛固定,石蠟包埋,切片,HE染色,在400×光學(xué)顯微鏡下觀察移植瘤的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　9.CD31免疫組化檢測和陽性細(xì)胞計數(shù)。給藥后第35天取出移植瘤,10%甲醛固定,石蠟包埋,切片,用鼠抗人的CD31單克隆抗體標(biāo)記,于400×光學(xué)顯微鏡下觀察并統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)。
　　實驗結(jié)果

7、：
　　在體外實驗中,可觀察到2-DG作用HUVECs12h時有顯著抑制其成管、遷移的作用,在6mM2-DG的作用下HUVECs不能形成連續(xù)的管腔結(jié)構(gòu);在細(xì)胞遷移實驗中,對照組的HUVECs遷移入整個劃痕區(qū),而6mM實驗組的細(xì)胞遷移率不超過50%;2-DG作用HUVECs24h可誘導(dǎo)其凋亡,6mM和9mM2-DG有顯著誘導(dǎo)HUVECs凋亡的能力,凋亡率分別為21.77%和25.07%,而對照組的細(xì)胞凋亡率為10.63%。倒置顯微鏡

8、下細(xì)胞形態(tài)學(xué)實驗表明對照組的細(xì)胞數(shù)量呈持續(xù)性增多的趨勢,細(xì)胞為梭形,呈鋪路石樣生長,而實驗組的細(xì)胞數(shù)量則有不同程度的減少,細(xì)胞形態(tài)亦發(fā)生明顯改變,鏡下可見大量受損細(xì)胞和脫落細(xì)胞。72h時MTT試驗顯示,與對照組的高細(xì)胞活力相比,0.6mM2-DG對HUVECs的增殖有抑制作用,6mM和9mM2-DG的抑制能力更加明顯,均在60%以上。
　　在體外實驗中,可觀察到2-DG對移植瘤的生長有明顯的抑制作用,對照組裸鼠的移植瘤體積呈逐漸增

9、大的趨勢,而實驗組的移植瘤體積則緩慢地減小,對照組的病理切片可觀察到典型的血管瘤鏡下表現(xiàn),內(nèi)皮細(xì)胞增殖并形成大量管腔樣結(jié)構(gòu),而實驗組的管腔結(jié)構(gòu)明顯較少,僅為對照組的一半,炎性細(xì)胞增多,大量纖維組織和脂肪組織浸潤。
　　結(jié)論：
　　本研究通過體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)2-DG能顯著抑制HUVECs的增殖、遷移和成管,使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,同時能誘導(dǎo)HUVECs的凋亡;體外實驗中2-DG能使移植瘤體積減小,管腔樣結(jié)構(gòu)明顯減少,纖維組織增