腎上腺素刺激的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)實驗性肺損傷的研究.pdf

1、急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是引起重癥患者急性呼吸衰竭的最主要的原因，死亡率高達(dá)40％。臨床前研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)移植可以減輕多種實驗性肺損傷，包括LPS、博萊霉素、機械通氣和缺血再灌注誘導(dǎo)的肺損傷。早期的研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可以通過分化為肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞來促進肺損傷修復(fù)。近年來，一些實驗研究發(fā)現(xiàn)BMSCs可以

2、通過一些旁分泌的因子調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)來修復(fù)肺損傷。小鼠膿毒癥模型中，BMSCs通過釋放前列腺素E2促進巨噬細(xì)胞抗炎因子IL-10的產(chǎn)生，從而降低死亡率和減輕肺損傷。BMSCs通過旁分泌IL-1受體拮抗劑(IL-1 receptor antagonist，IL-1ra)抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而保護博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥性損傷。
　　一些實驗性肺損傷中，腎上腺素能受體激動劑特別是β腎上腺素能受體激動劑，可以通過促進肺水吸收和抑

3、制炎癥反應(yīng)來促進肺損傷修復(fù)。腎上腺素能受體激動劑還可以促進胚胎干細(xì)胞和BMSCs的DNA合成，保護間充質(zhì)干細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。
　　本研究首先評估BMSCs移植對大鼠鹽酸吸入性肺損傷的作用及其機制;研究不同的腎上腺素能受體激動劑和拮抗劑對BMSCs生物學(xué)行為的影響:在體外模型中研究腎上腺素對BMSCs遷移的影響，并且在體外和體內(nèi)實驗中評估腎上腺素是否可以幫助BMSCs調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和修復(fù)實驗性肺損傷，同時初步探討其機制。
　　

4、第一部分、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植減輕大鼠鹽酸吸入性肺損傷的作用及其機制
　　目的:研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對大鼠鹽酸吸入性肺損傷的作用并探討機制。
　　方法:本實驗于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實驗研究中心進行。改良貼壁法分離培養(yǎng)Sprague-Dawley(SD)大鼠BMSCs，進行形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)記物和誘導(dǎo)分化鑒定。24只SD大鼠隨機分為3組:對照組，損傷組和移植組。損傷組和移植組氣道內(nèi)滴注鹽酸(1.2ml/kg pH

5、=1.5)，對照組則滴入等量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，用動脈血氣、肺組織濕干比和病理改變評價模型是否成功建立。移植組于頸外靜脈注射5×106個BMSCs，其它2組注入0.5ml的PBS。移植6h后行動脈血氣分析，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)濃度，觀察肺組織病理改變和測定肺組織濕干比。體外實驗中，BMSCs與損傷肺細(xì)胞

6、或正常肺細(xì)胞于Transwell體系共培養(yǎng)36h，觀察損傷肺影響B(tài)MSCs遷移情況;另取BMSCs與損傷肺細(xì)胞混合培養(yǎng)或于Transwell中培養(yǎng)，正常肺細(xì)胞或損傷肺細(xì)胞單獨培養(yǎng)作對照，6h后檢測上清TNF-α、IL-6和IL-10濃度。用方差分析比較多組間的差異，獨立樣本t檢驗比較兩組的差別。
　　結(jié)果:分離培養(yǎng)的BMSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。BMSCs移植改善了肺損傷大鼠的低氧血癥(P＜0.01)和肺組織損傷，降低了肺組織

7、濕干比(P＜0.01)，降低了血清和BALF的TNF-α水平(P＜0.05;P＜0.01)，升高了血清和BALF的IL-10濃度（P＜0.01），對IL-6水平無明顯影響（P＞0.05）。體外實驗中，BMSCs向損傷肺遷移明顯多于向正常肺遷移(P＜0.01)，BMSCs與肺細(xì)胞接觸或不接觸的共培養(yǎng)均降低了上清液TNF-α濃度（P＜0.01），升高了IL-10濃度（P＜0.01），對IL-6濃度無影響(P＞0.05)。
　　結(jié)論:B

8、MSCs移植可以減輕大鼠鹽酸吸入性肺損傷，可能的機制為干細(xì)胞通過旁分泌途徑下調(diào)炎癥反應(yīng)。
　　第二部分、腎上腺素能受體參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的研究
　　目的:研究不同的腎上腺素能受體激動劑和拮抗劑對BMSCs生物學(xué)行為的影響。
　　方法:用不同濃度的腎上腺素(0-100μM)，α受體激動劑去甲腎上腺素，β受體激動劑異丙腎上腺素，或聯(lián)用腎上腺素和受體拮抗劑作用于BMSCs，在Cell-IQ實時細(xì)胞監(jiān)測平臺觀察細(xì)胞增殖、

9、死亡和運動。每5min拍攝一次，連續(xù)觀察72 h后計算細(xì)胞總數(shù)增加百分比、分裂細(xì)胞數(shù)、死亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞移動距離。
　　結(jié)果:10μM濃度的腎上腺素同對照相比，可以顯著加速細(xì)胞增殖，這個作用6h時開始出現(xiàn)，18-24 h時達(dá)到高峰;而促進細(xì)胞分裂的作用逐漸出現(xiàn)，36h時到達(dá)高峰。1μM濃度的腎上腺素對細(xì)胞增殖無顯著影響，而100μM的腎上腺素可以抑制增殖。各濃度的腎上腺素對死亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞運動距離無影響。因此后續(xù)實驗選擇10μM濃度

10、進行研究。10μM濃度的去甲腎上腺素和異丙腎上腺素促進細(xì)胞增殖的作用類似，而均弱于同樣濃度的腎上腺素。去甲腎上腺素和異丙腎上腺素對細(xì)胞死亡和細(xì)胞運動均無明顯影響。10μM濃度的酚妥拉明和普萘洛爾和腎上腺素分別聯(lián)用時，對細(xì)胞增殖有類似的抑制作用。酚妥拉明和普萘洛爾和腎上腺素分別聯(lián)用時，對細(xì)胞死亡和運動無顯著影響。
　　結(jié)論:10μM濃度的腎上腺素具有促進BMSCs增殖的作用，并且是腎上腺素能受體相關(guān)的，α或β受體激動后均有促增殖效應(yīng)

11、。
　　第三部分、腎上腺素刺激的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進LPS誘導(dǎo)急性肺損傷修復(fù)的作用及機制探討
　　目的:評估腎上腺素刺激的BMSCs是否可以減輕體內(nèi)和體外模型中的LPS肺損傷并探討其機制。
　　方法:將正常大鼠的肺細(xì)胞或LPS損傷大鼠的肺細(xì)胞與BMSCs（有或無腎上腺素刺激）共培養(yǎng)于Transwell中(膜孔徑8 um)，36h后計數(shù)遷移的BMSCs數(shù)量。另將正常大鼠或LPS損傷大鼠的肺組織塊與BMSCs（有或無腎上腺

12、素刺激）共培養(yǎng)于6孔板中，24h后觀察并計數(shù)向肺組織遷移和粘附的BMSCs數(shù)量。LPS刺激的巨噬細(xì)胞和BMSCs共培養(yǎng)于Transwell中(膜孔徑0.4um)，6h后取上清液ELISA檢測TNF-α, IL-1β，IL-6，IL-10，IL-13，血管生成素-1，KGF和IL-1ra濃度。同時取BMSCs用實時定量PCR測血管生成素-1，KGF，IL-1ra，IL-10和IL-13基因表達(dá)。Western blot測BMSCs的IL-

13、10，IL-13，KGF和IL-1ra蛋白表達(dá)。初步的動物實驗用于驗證體外實驗的發(fā)現(xiàn)，大鼠靜脈注射BMSCs，腎上腺素刺激的BMSCs，BMSCs（有或無腎上腺素刺激）的條件培養(yǎng)液，腎上腺素或PBS進行預(yù)處理，24 h后氣管內(nèi)注射LPS造模。造模后24h觀察肺組織病理改變。
　　結(jié)果:10μM濃度的腎上腺素促進了BMSCs向損傷肺細(xì)胞的遷移，還促進了向損傷肺組織的遷移和粘附。體外肺損傷模型中，腎上腺素刺激的BMSCs降低了TNF-

14、α和IL-1β濃度，升高了IL-10濃度，促進了炎癥反應(yīng)的下調(diào)，而這個作用可能與腎上腺素促進一些旁分泌因子包括血管生成素-1，KGF，IL-1ra，IL-10和IL-13的表達(dá)和分泌有關(guān)。動物實驗中，腎上腺素刺激的BMSCs促進了肺損傷的修復(fù)。結(jié)論:腎上腺素通過腎上腺素能受體激活BMSCs，促進BMSCs增殖和向損傷肺的遷移，與損傷肺相互作用，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，從而促進了肺損傷的修復(fù)。
　　結(jié)論：
　　1.BMSCs移植可以減輕

15、大鼠鹽酸吸入性肺損傷，可能的機制為干細(xì)胞通過旁分泌途徑下調(diào)炎癥反應(yīng)。
　　2.10μM濃度的腎上腺素具有促進BMSCs增殖的作用，并且是腎上腺素能受體相關(guān)的，α或β受體激動后均有促增殖效應(yīng)。
　　3.腎上腺素激活BMSCs，促進BMSCs增殖和向損傷肺的遷移，與損傷肺相互作用，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，從而促進了肺損傷的修復(fù)。
　　創(chuàng)新點：
　　1.我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，在體外共培養(yǎng)模型中，損傷肺組織可以促進BMSCs的遷移和