RyR-2基因敲除減弱壓力超負(fù)荷后心肌肥厚和降低心功能機(jī)制研究.pdf

1、蘭尼堿2型受體(Ryanodine receptot type2 RyR-2)主要存在于心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，介導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Calciumion Ca2+)釋放，Ca2+在心肌細(xì)胞的興奮一收縮耦聯(lián)中起關(guān)鍵作用，心肌細(xì)胞的每一次舒縮都伴有胞漿內(nèi)Ca2+濃度的增高和恢復(fù)，除此之外，越來(lái)越多研究表明Ca2+也參與病理?xiàng)l件下心室重構(gòu)及心力衰竭的發(fā)生過(guò)程。然而，在心室重構(gòu)及心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中，RyR-2受體的作用機(jī)制依然不甚明了。
　

2、　 應(yīng)用野生型小鼠(WT)及RyR-2基因敲除小鼠(RyR-2+/-)通過(guò)升主動(dòng)脈縮窄的方法構(gòu)建壓力超負(fù)荷引起的心室重構(gòu)模型，進(jìn)行RyR-2的分子機(jī)制研究。結(jié)果表明，在基礎(chǔ)生理?xiàng)l件下，與RyR-2+/+小鼠相比，RyR-2+/-小鼠盡管已經(jīng)出現(xiàn)明顯Ca2+釋放異常，但在心肌細(xì)胞大小、心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)和心肌收縮功能等方面卻無(wú)明顯差異；主動(dòng)脈縮窄后，小鼠心臟壓力負(fù)荷增加，3周后，各組小鼠均發(fā)生了明顯的心室重構(gòu)--心肌肥厚，而相對(duì)WT小鼠，Ry

3、R-2+/-小鼠的肥厚程度明顯減弱、心肌纖維化程度以及收縮功能的減弱程度明顯減輕，這些改變與心肌細(xì)胞凋亡增加而心肌細(xì)胞自噬減少有關(guān)，與心臟中微血管生成無(wú)關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，一系列Ca2+調(diào)節(jié)蛋白包括L型鈣通道(L-type Ca2+channel，LCC)、鈉鈣交換體(Na1+/Ca2+exchanger，NCX)、鈣離子ATP酶2(SR Ca2+-ATPase2，SERCA2)的基因表達(dá)紊亂；壓力超負(fù)荷后RyR-2+/-小鼠心臟中與R

4、yR-2受體結(jié)合的結(jié)合蛋白FKBP量減少而另一種與RyR-2受體結(jié)合的蛋白PKA量卻增加。除此之外，我們還進(jìn)一步分析了Ca2+依賴(lài)的蛋白激酶途徑發(fā)現(xiàn)RyR-2是鈣神經(jīng)素(calcineurin)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated protein kinases，ERE)和蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)的調(diào)節(jié)因子，而在Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/cal

5、modulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKII)途徑中影響不大。
　　 由此可見(jiàn)，RyR-2受體的缺失破壞了細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、增加心肌細(xì)胞凋亡而減少自噬、影響Ca2+相關(guān)蛋白激酶的活性從而減弱了心肌細(xì)胞對(duì)壓力負(fù)荷增加所產(chǎn)生的重構(gòu)改變，影響心臟功能，參與心力衰竭的發(fā)生。
　　 第一部分、RyR-2基因敲除對(duì)壓力超負(fù)荷后心肌肥厚發(fā)生和心功能的影響
　　 目的：通過(guò)敲除RyR-2基因探討該

6、基因?qū)π募〖?xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的影響并觀察RyR-2基因敲除小鼠在壓力超負(fù)荷情況下心肌肥厚的發(fā)生情況。
　　 方法：應(yīng)用Langendorff裝置體外灌流的方法獲得并培養(yǎng)成年RyR-2+/+和RyR-2+/-小鼠心肌細(xì)胞，用AngⅡ作為刺激因素之一，3-4μ mol/L fluo-3 AM孵育標(biāo)記心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+，在波長(zhǎng)485nm時(shí)，分別激發(fā)心肌細(xì)胞熒光。應(yīng)用熒光顯微鏡，經(jīng)過(guò)530 nm帶通濾波，觀察激發(fā)出的熒光，并收集數(shù)據(jù)用來(lái)

7、反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。，用0.25HZ電場(chǎng)刺激2min誘發(fā)心肌細(xì)胞收縮，隨后將10 mmol/L咖啡因加入細(xì)胞中以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣貯存的釋放，分析細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變。實(shí)驗(yàn)分RyR-2+/+小鼠組和RyR-2+/-組。分別將RyR-2+/+小鼠和RyR-2+/-小鼠隨機(jī)分為T(mén)AC(Transverse aorta constriction)組和Sham組，分別給予縮窄升主動(dòng)脈或假手術(shù)，三周后行心臟超聲和新導(dǎo)管檢查評(píng)價(jià)小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能改變。HE染

8、色和V-G染色分別觀察心室重構(gòu)和纖維化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1)RyR-2基因敲除后，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變幅度、收縮期胞內(nèi)Ca2+濃度升高幅度、縮短分?jǐn)?shù)百分率(FS％)等反應(yīng)心臟收縮功能指標(biāo)均明顯降低。
　　 2)咖啡因誘導(dǎo)細(xì)胞收縮后細(xì)胞半舒張期時(shí)間在兩組之間無(wú)明顯變化。
　　 3)生理?xiàng)l件下，WT小鼠和RyR-2+/-小鼠的心臟無(wú)論在結(jié)構(gòu)和收縮功能上均沒(méi)有明顯差別。
　　 4)TAC三周后，無(wú)

9、論是WT小鼠還是RyR-2+/-小鼠均發(fā)生心肌肥厚，但二者之間肥厚程度有顯著差別。與WT小鼠i相比，RyR-2+/-小鼠肥厚程度明顯減輕。
　　 5)TAC三周后，與WT小鼠相比，RyR-2+/-小鼠的室間隔厚度(IVSTd)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、dP/dtmax著減少而，左室舒張末壓力增高。
　　 6)組織化學(xué)結(jié)果顯示TAC術(shù)后，與WT小鼠相比，RyR-2+/-小鼠心肌細(xì)胞增大程度、肌纖維增粗和纖維化程度均減弱。

10、
　　 7)AngⅡ刺激并沒(méi)有引起收縮期或舒張期細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的改變。
　　 結(jié)論：
　　 1)RyR-2基因敲除后，小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)發(fā)生明顯改變，提示RyR-2基因可能參與Ca2+介導(dǎo)的心肌肥厚的發(fā)生。
　　 2)盡管在生理?xiàng)l件下RyR-2基因敲除無(wú)明顯心臟異常，但在RyR-2敲除動(dòng)物中壓力負(fù)荷增引起的心肌肥厚明顯減弱。
　　 第二部分、RyR-2基因?qū)π募》屎裣嚓P(guān)基因和Ca2+調(diào)

11、節(jié)蛋白影響
　　 目的：觀察RyR-2基因敲除后，壓力負(fù)荷增加時(shí)心肌肥大標(biāo)志基因和鈣調(diào)控蛋白變化情況。
　　 方法：RyR-2+/+小鼠和RyR-2+/-小鼠行TAC術(shù)，2天和三周后分別獲取標(biāo)本，應(yīng)用northern blotting方法檢測(cè)肥大基因ANP、BNP、鈣離子通道蛋白LCC、SERCA2、NCX的基因表達(dá)情況；應(yīng)用免疫共沉淀方法觀察RyR-2結(jié)合蛋白FKBP、PKA等量的改變。同時(shí)假手術(shù)組作為對(duì)照。
　

12、　 結(jié)果：
　　 1)TAC引起ANP和BNP基因表達(dá)增高，TAC引起ANP和BNP基因表達(dá)增高在RyR-2+/-小鼠組中程度有所減輕2)TAC2天和三周后RyR-2+/+小鼠α-SKA表達(dá)增高水平一致，而RyR-2+/-小鼠中TAC3周后α-SKA出現(xiàn)更明顯的增高。
　　 3)TAC誘導(dǎo)RyR-2+/+小鼠RyR-2和SERCA2基因表達(dá)下調(diào)而LCC和NCX基因表達(dá)上調(diào)。TAC誘導(dǎo)RyR-2+/-小鼠NCX基因表達(dá)下

13、調(diào)而SERCA2和LCC基因表達(dá)不變4)基礎(chǔ)條件下，與RyR-2結(jié)合的FKBP的量在RyR-2+/-小鼠有所減少，而與RyR-2結(jié)合的PKA的量卻呈現(xiàn)出增加。TAC3周后，與RyR-2結(jié)合的FKBP的量在WT和RyR-2+/-小鼠中均減少，與RyR-2結(jié)合的PKA的量均增加。
　　 結(jié)論：RyR-2基因敲除后影響了壓力負(fù)荷增加所致肥厚基因的表達(dá)并引起鈣通道蛋白表達(dá)異常。
　　 第三部分、RyR-2基因敲除減弱肥大信號(hào)傳導(dǎo)

14、途徑的激活
　　 目的：觀察TAC后WT和RyR-2+/-小鼠心臟中不同肥大信號(hào)途徑中激酶如CaMKⅡ、鈣神經(jīng)素(calcineurin)、ERK和AKT的表達(dá)變化。
　　 方法：手術(shù)和分組同前，獲取小鼠心臟組織標(biāo)本，應(yīng)用western blotting的方法檢測(cè)CaMKⅡ、calcineurin、ERK和AKT蛋白表達(dá)；體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞以不同濃度AngⅡ刺激，檢測(cè)CaMKⅡ和talcineurin活性改變。
　　

15、 結(jié)果：
　　 1)AngⅡ以劑量依賴(lài)方式迅速激活CaMKⅡ，CaMKⅡ活性顯著增加；而對(duì)calcineurin，AngⅡ并沒(méi)有顯著激活作用。
　　 2)WT小鼠中壓力超負(fù)荷增加CaMKⅡ和calcineurin表達(dá)；RyR-2+/-小鼠中壓力超負(fù)荷引起CaMKⅡ表達(dá)增加而calcineurin途徑無(wú)明顯激活。
　　 3)WT小鼠中TAC3周后顯著激活ERK、AKT通路而RyR-2+/-小鼠兩條通路無(wú)明顯激活改

16、變。
　　 結(jié)論：敲除RyR-2基因減弱壓力超負(fù)荷引起肥大反應(yīng)是通過(guò)影響calcineurin信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的。
　　 第四部分、RyR-2基因敲除后壓力超負(fù)荷引起心功能減退的可能機(jī)制研究
　　 目的：從凋亡、自噬及血管發(fā)生情況方面分析RyR-2基因可能的影響心功能的機(jī)制。
　　 方法：臨床收集5例心臟組織標(biāo)本，分為心衰組和正常對(duì)照組，分析RyR-2基因表達(dá)，動(dòng)物分組及手術(shù)方法同前，獲取心臟標(biāo)本，組織切片染

17、色，TUNEL方法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，免疫染色和Western Blotting方法檢測(cè)細(xì)胞自噬和微血管計(jì)數(shù)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1)衰竭心臟中RyR-2基因表達(dá)降低，降低程度與心功能狀態(tài)正相關(guān)。
　　 2)RyR-2+/-小鼠中TAC后，心肌細(xì)胞凋亡較RyR-2+/+明顯增加。
　　 3)RyR-2+/-小鼠中TAC后，心肌細(xì)胞自噬較RyR-2+/+明顯增加。
　　 4)RyR-2+/-