羽衣甘藍(lán)自交不親和相關(guān)基因的分離及反應(yīng)途徑中蛋白質(zhì)磷酸化和泛素化的動態(tài)變化.pdf

1、花粉與柱頭間的信號識別與傳遞，是植物進(jìn)行受精作用的前提條件。植物自交不親和性(Self- incompatibility，SI)是指雌蕊對自己和異己花粉進(jìn)行識別，通過細(xì)胞內(nèi)信號傳遞與級聯(lián)反應(yīng)，最終抑制自己花粉的生長，阻礙受精作用的過程。SI 是植物采取的一種促進(jìn)異交、避免自交的策略。對植物SI信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究，不僅在植物生殖生物學(xué)上具有重要的意義，而且在育種上也具有實際的應(yīng)用價值。本文以羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var

2、.acephala)為實驗材料，對SI進(jìn)行了如下方面的研究： 1. 羽衣甘藍(lán)S<,13b>單倍型純合體的鑒定以羽衣甘藍(lán)‘赤兔’和‘白波’兩個品種為實驗材料，利用親和指數(shù)法經(jīng)過3代的自交選育，獲得了 9 號自交不親和系和 14 號自交親和系。利用 SRK 特異性引物 PK1 和PK4，采用 PCR 方法分別從花期柱頭和葉片中分離出9號自交不親和系SRK的cDNA和DNA序列。經(jīng)過 Blastn 分析表明，獲得的序列與甘藍(lán)SRK<,

3、13b>序列完全一致，因此認(rèn)為9號自交不親和系含有S<,13b>單倍型。通過對9號自交不親和系、9號自交后代、9號×14號雜交F<,1>代及14號自交親和系進(jìn)行了SRK的PCR-RFLP和Southern雜交分析，鑒定出9號自交不親和系是S<,13b>單倍型純合體。 2．分離羽衣甘藍(lán)S<,13b>S<,13b>自交不親和系花粉中的SCR<,13b>利用SCR基因保守的信號肽編碼區(qū)設(shè)計 SCR 特異性引物1和錨定 oligo(dT

4、)<,18>引物，采用RF-PCR方法從羽衣甘藍(lán)蕾期花藥中分離SCR<,13b>的cDNA片段。經(jīng)過Blastn分析表明，羽衣甘藍(lán)SCR<,13b>與甘藍(lán)SCR<,13>序列具有高度的同源性，差異僅在于3個核苷酸(AAG)的插入和3個核苷酸(TT和C)的缺失。然后，利用甘藍(lán)SCR<,13>的5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)設(shè)計SCR<,13b>的特異性引物，獲得了羽衣甘藍(lán)SCR<,13b>編碼區(qū)序列。SCR<,13b>編碼78個氨基酸，其氨基

5、酸序列與甘藍(lán)SCR<,13>有98.3％的序列一致性。SCR<,13b>基因DNA序列中含有一個758 bp的內(nèi)含子，內(nèi)含子的5’供體位點和3’受體位點邊界序列分別是5’-GU和3’-AG，符合內(nèi)含子邊界序列的GU-AG規(guī)則。 將分離的羽衣甘藍(lán)SCR<,13b>成熟肽編碼區(qū)插入到pGEX-KG、pET-32a 原核表達(dá)載體中，構(gòu)建 pGEX-KG-SCR<,13b>和pET-32a-SCR<,13b>表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化到 DH5

6、α、BL21(DE3)pLysS表達(dá)菌株中，通過蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化，獲得GST-SCR<,13b>和His-SCR<,13b>融合蛋白。利用生物授粉分析的方法，將GST-SCR<,13b>及His-SCR<,13b>融合蛋白涂抹在羽衣甘藍(lán)S<,13b>S<,13b>自交不親和系柱頭乳突細(xì)胞上，然后進(jìn)行與14號自交親和系的雜交授粉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S<,13b>S<,13b>柱頭乳突細(xì)胞產(chǎn)生了SI反應(yīng)，抑制了14號花粉的生長。這說明羽衣甘藍(lán)SCR

7、<,13b>是花粉中SI的信號分子，引起了SI反應(yīng)從而干擾了雜交親和授粉。 S<,13b>單倍型與S<,13b>單倍型具有相同的SI識別特異性，但SCR<,13b>與SCR<,13b>具有不同的核酸序列。本研究分離出的羽衣甘藍(lán)SCR<,13b>，其氨基酸序列不同于甘藍(lán)SCR<,13b>，但具有較高的一致性。羽衣甘藍(lán)SCR<,13b>與其它的SCR氨基酸序列比對時發(fā)現(xiàn)，有7個半胱氨酸殘基在SCR成熟肽內(nèi)是保守的。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

8、，SCR的聚類足根據(jù)SI強(qiáng)弱性質(zhì)而劃分的，而不是根據(jù)物種進(jìn)行聚類的。 3．分離鑒定羽衣甘藍(lán)SI信號傳遞因子BoARC1利用油菜BnARC1的序列設(shè)計引物，采用RT-PCR方法從花期柱頭中分離出羽衣甘藍(lán)BoARC1。它編碼一個663個氨基酸，分了量約為73 kDa的蛋白質(zhì)。在氨基酸序列比對中，BoARC1與BnARC1具有94％的一致性。Southern雜交顯示，BoARC1在羽衣甘藍(lán)S<,13b>S<,13b>自交不親和系基因組

9、中只存在單一拷貝。Northern雜交分析表明，BoARC1特異性的在植株開花或接近開花時期的柱頭中表達(dá)。在酵母雙雜交實驗中，BoARC1能夠通過C端的臂重復(fù)結(jié)構(gòu)域分別與SRK<,3>、SRK<,13b>和SRK<,910>的胞內(nèi)域相互作用。這些說明了BoARC1是SRK下游的一個保守信號成分，參與SI信號的傳遞。 BoARC1 含有 U-box 結(jié)構(gòu)域和臂重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，是植物中一類特有的蛋白質(zhì)。在系統(tǒng)進(jìn)化分析中，BoAR

10、C1 和 BnARC1 主要與擬南芥的 PUB17、煙草和馬鈴薯的 ACRE276 蛋白質(zhì)、水稻 ACRE 蛋白質(zhì)聚類在一起。而這些蛋白質(zhì)主要在植物的疾病防御方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。這暗示著 BoARC1 可能在植物其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面也發(fā)揮著重要作用。 4．SI反應(yīng)途徑中蛋白質(zhì)磷酸化、泛素化的動態(tài)變化利用磷酸化蛋白質(zhì)探針和免疫印跡方法，檢測羽衣甘藍(lán)S<,13b>S<,13b>自交不親和系自交授粉過程中柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化的動態(tài)變化

11、。發(fā)現(xiàn)自交授粉5 min的柱頭乳突細(xì)胞膜蛋白質(zhì)磷酸化水平出現(xiàn)高峰：自交授粉15 min的柱頭乳突細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)磷酸化水平出現(xiàn)高峰，隨后蛋白質(zhì)磷酸化又逐漸地恢復(fù)到未授粉水平。而在S<,13b>S<,13b>×14號雜交親和授粉過程中，蛋白質(zhì)磷酸化的動態(tài)變化水平是比較穩(wěn)定的。此外，利用抗泛素抗體和免疫印跡方法，檢測羽衣甘藍(lán)S<,13b>S<,13b>自交不親和授粉過程中柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化水平變化。發(fā)現(xiàn)在自交授粉0.5 h蛋白質(zhì)泛素化水

12、平明顯增高，直到1h蛋白質(zhì)泛素化水平仍然維持著較高水平。而在S<,13b>S<,13b>×14號雜交親和授粉過程中，柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化水平并沒有出現(xiàn)增高的趨勢。蛋白質(zhì)磷酸化發(fā)生在SI信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的早期階段，可能在調(diào)控柱頭乳突細(xì)胞對細(xì)胞外的信號識別及細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞方面扮演著重要角色。而蛋白質(zhì)泛素化水平的變化發(fā)生在SI信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的后期階段，可能通過降解柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)來參與SI反應(yīng)。蛋白質(zhì)磷酸化與泛素化的協(xié)同作用調(diào)控SI的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)