羽衣甘藍SRK和SCR的克隆表達及克服自交不親和性的研究.pdf

1、羽衣甘藍(Brassica oleracea vat．a(chǎn)cephala)是一種典型的孢子體型自交不親和性(Self-incompatibilitv，SI)植物，在遺傳上，羽衣甘藍SI受具有復等位基因的S單倍型控制，并且認為S單倍型上S受體蛋白激酶(S-locus receptor kinase，SRK)和S位點富含半胱氨酸的蛋白(S-locus cysteine-rich protein，SCR)/SPll(S-loctls prote

2、in 11)分別控制著花粉(雄性)和柱頭乳突細胞(雌性)的SI。本文獲得了。SRK激酶域的cDNA片段、SRK表達的全長序列、SCR cDNA序列和SCR DNA序列克隆共四個克隆。確定了本試驗材料9號“赤兔”自交不親和系的基因型為S<,13b>單倍型。并進行了一些克服花粉自交不親和性的探索性試驗。得到以下結(jié)論： (1)采用Northern雜交方法確定了SRK基因只在>10mm和8-10mm長的花蕾中有表達，且>10mm花蕾的表

3、達量大于8-10mm花蕾的表達量。 (2)分離出一種新基因SCR<,13b>，此基因與SCR<,13>序列有較高的同源性，它含有一個758 bp的內(nèi)含子，編碼一個由78個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。SCR<,13b>在N端含有24個氨基酸的信號肽區(qū)域，在C端有由54個氨基酸組成的成熟蛋白區(qū)域。在原核細胞中表達并純化了SCR<,13b>蛋白，獲得了一個約32kDa左右的蛋白質(zhì)條帶，為進一步探討SCR<,13b>的功能奠定了基礎(chǔ)。

4、(3)確定了克服花粉白交不親和性的CO<,2>激光和高壓靜電場的處理劑量，即CO<,2>激光的T<,1>S<,1>(燒灼延時5’，照射一次)處理，高壓靜電場的E3(75kV/m)處理。 (4)通過測量花粉管萌發(fā)率及一定時間內(nèi)花粉管的萌發(fā)長度，我們知道在花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中加入自交不親和系同株柱頭的蛋白粗提物會抑制花粉管的萌發(fā)和生長。萌發(fā)前加入不親和柱頭蛋白，電場處理的萌發(fā)率高于未處理花粉的萌發(fā)率；萌發(fā)后加入不親和柱頭蛋白，電場處理過

5、的花粉管能繼續(xù)生長，而未處理的花粉管則停止生長。 (5)用nuo-3標汜花粉管中的Ca<'2+>，激光共聚焦顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)電場處理過的花粉受到不親和刺激后仍然保持著Ca<'2+>濃度梯度，花粉管可繼續(xù)生長；而沒有被電場處理過的花粉受到不親和刺激后其Ca<'2+>濃度梯度消失，Ca<'2+>在花粉管內(nèi)呈彌散狀態(tài)。 (6)通過蛋白質(zhì)雙向電泳實驗，我們比較了電場處理花粉自交授粉3h(電場)后柱頭蛋白的表達、未處理花粉自交授粉