甘藍(lán)自交不親和相關(guān)基因KAPP的克隆及其與THL1的雙色FISH定位研究.pdf

1、自交不親和性是顯花植物一種重要的防止近親遺傳、增加變異的機(jī)制，其實(shí)質(zhì)則是一種由花粉和柱頭中的配體和受體相互識(shí)別后引發(fā)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。包括甘藍(lán)在內(nèi)的蕓薹屬植物的自交不親和性受一個(gè)帶有復(fù)等位基因的多態(tài)性S基因位點(diǎn)控制。但是，S-locus與SI下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的編碼基因之間在染色體的物理位置關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道，它們之間是否具有連鎖性以及這些下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子在甘藍(lán)染色體組中的分布位置也尚未知曉。此外，甘監(jiān)作為蕓整屬的三個(gè)基本種之一，在其進(jìn)化

2、和新種合成過(guò)程中，發(fā)生了大量重組和遺傳變異事件。這極大地影響著甘藍(lán)自交不親和基因在蕓薹屬間的轉(zhuǎn)移和遺傳變異。其次，對(duì)于KAPP這種廣泛在受體蛋白激酶介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起下調(diào)作用的蛋白因子的編碼基因的研究還不夠深入。所以本研究不僅對(duì)甘藍(lán)KAPP基因進(jìn)行了克隆和序列分析還通過(guò)雙色FISH技術(shù)將KAPP與THL1兩個(gè)SI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)基因在不同的靶DNA載體上進(jìn)行定位。得到的主要研究結(jié)果如下：
　　 ⑴采用PCR、RT-PC

3、R及其他分子生物學(xué)方法，以甘藍(lán)基因組DNA、花蕾RNA和葉片RNA為模板，分別對(duì)甘藍(lán)KAPP gDNA和KAPP cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為3247bp的KAPPgDNA片段，以及長(zhǎng)度分別為1699bp的KAPPcDNA片段、1578 bp的花蕾KAPP2 cDNA片段和1581bp的葉片KAPP2 cDNA片段。對(duì)克隆的甘藍(lán)KAPP gDNA和cDNA(結(jié)合報(bào)道的KAPPcDNA)進(jìn)行比對(duì)表明，甘藍(lán)KAPP基因包含11個(gè)內(nèi)含子，均符

4、合“GU-AG”剪接規(guī)則，并且克隆得到的KAPP cDNA序列與報(bào)道的KAPP cDNA序列有6處單個(gè)堿基的差異，但兩者的氨基酸序列完全一致。然而花蕾KAPP2 cDNA、葉片KAPP2 cDNA片段與報(bào)道的KAPPcDNA序列相似性分別為85.2％和85.0％。這兩個(gè)序列分別在590bp和593bp處均較早出現(xiàn)了一個(gè)無(wú)義突變引起的終止密碼子。Blast分析表明，兩基因編碼的氨基酸序列與擬南芥KAPP氨基酸序列相似性最高，其次為甘藍(lán)KA

5、PP氨基酸序列。對(duì)已報(bào)道的8種植物KAPP的CDS序列及本實(shí)驗(yàn)所克隆的兩個(gè)KAPP2序列構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)表明，獲得序列與甘藍(lán)KAPP序列聚為一支。結(jié)合比較作圖及分子進(jìn)化樹(shù)，推測(cè)KAPP基因在甘藍(lán)基因組上有兩個(gè)拷貝，而筆者克隆到的KAPP2cDNA序列是其另一個(gè)拷貝，是KAPP進(jìn)化過(guò)程中突變失活的擬基因。
　　 ⑵通過(guò)對(duì)相關(guān)程序的摸索使甘藍(lán)的FISH靶DNA制備技術(shù)得到進(jìn)一步的優(yōu)化。利用這些優(yōu)化的制備技術(shù)進(jìn)而得到了適用于FISH的甘

6、藍(lán)前中期和中期染色體制片，以及偶線期到粗線期的染色體制片。本研究通過(guò)對(duì)同步處理中冷處理時(shí)間的優(yōu)化得到了最合適的冷處理時(shí)間為12h。此外對(duì)8-羥基喹啉預(yù)處理時(shí)間的優(yōu)化得到了更適合用于FISH的染色體的預(yù)處理時(shí)間為50-65min。在偶線期到粗線期染色體載體制備上采用2.5％(w/v)纖維素酶和2.5％(w/v)果膠酶的混合液37℃對(duì)其進(jìn)行酶解處理1h左右，然后烤片壓片所得到的染色體制片背景最干凈伸展?fàn)顟B(tài)最好。
　　 ⑶通過(guò)對(duì)已有的

7、FISH技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，適當(dāng)進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)得劍了適用于不同靶DNA載體的雙色FISH技術(shù)體系。其中前中期和中期染色體制片的前處理酶解時(shí)間均為40min，而偶線期劍粗線期染色體制片前處理時(shí)間則均為30min。在雜交過(guò)程中探針混合液的配比上去掉了硫酸葡聚糖，兩種不同標(biāo)記的探針混合比例為1:1，其他組分濃度不做更改。雜交后洗脫條件通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)在溫度上保持37℃不變分別于4×SSCT(0.2％Tween20)、2×SSC和1×PBS各洗脫4min3

8、0 Sec，其得到的雜交結(jié)果背景較淺，信號(hào)檢出率最高。
　　 ⑷采用雙色熒光原位雜交技術(shù)，對(duì)甘藍(lán)自交不親和相關(guān)基因KAPP與THL1在減數(shù)分裂偶線期到粗線期、有絲分裂中期與前中期等5種不同的靶DNA載體上進(jìn)行定位。結(jié)果表明，生物素標(biāo)記的KAPP探針信號(hào)檢測(cè)到了兩對(duì)同源信號(hào)，而地高辛標(biāo)記的THL1只檢測(cè)到一對(duì)同源信號(hào)。根據(jù)Armstrong的核型分析標(biāo)準(zhǔn)對(duì)有絲分裂前中期染色體進(jìn)行核型分析后發(fā)現(xiàn)，KAPP探針信號(hào)分別位于4號(hào)染色體短

9、臂部和9號(hào)染色體短臂端部，距著絲粒的百分距離分別為60.46±5.14和79.5±3.35；THL1探針信號(hào)位于5號(hào)染色體短臂部，距著絲粒的百分距離為65.42±2.82。綜合5種載體上的FISH結(jié)果表明，KAPP在甘藍(lán)染色體組中可能有兩個(gè)同源序列座有兩個(gè)拷貝，THL1在甘藍(lán)染色體組中為只有一個(gè)同源序列座為單拷貝基因。此外從比較基因組學(xué)的角度對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行了討論，并結(jié)合已有的研究結(jié)果初步判斷它們與S位點(diǎn)不存在連鎖關(guān)系。KAPP、THL1