豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組末端Poly（A）順式調(diào)控因子的解析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是套式病毒目(Nidovirales)，動脈炎病毒科(Arteriviridae)，動脈炎病毒屬(Arterivirus)的成員，基因組為單股正鏈RNA，全長為15kb左右，具有5′端帽結(jié)構(gòu)和3′poly(A)。單股正鏈RNA病毒基因組的poly(A)對其復制周期有著非常重要的作用。目前，關(guān)于PRR

2、SV基因組RNA poly(A)對病毒感染性、RNA合成過程的作用、機理和poly(A)的形成機制還不明確。在本實驗室建立的北美型PRRSV感染性克隆的基礎(chǔ)上，我們通過突變PCR獲得不同長度poly(A)以及可能poly(A)加尾信號的一系列全長突變cDNA克隆，從而研究PRRSV基因組poly(A)如何形成以及在病毒復制、轉(zhuǎn)錄過程中所起的作用?，F(xiàn)將研究內(nèi)容簡述如下： 1．本研究以豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)北美株感染

3、性克隆pCBC2為平臺進行反向遺傳操作，通過突變PCR獲得poly(A)長度分別為0、5、8、9、10、22、35的全長突變體克隆，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染MARC-145細胞，觀察細胞病變(CPE)，對于能產(chǎn)生CPE的，抽提細胞上清中的病毒RNA，通過G-Tailing法鑒定子代病毒基因組的poly(A)長度。結(jié)果表明：1)、poly(A)影@PRRSV基因組的感染性，且最小長度為10；2)、PRRSV基因組poly(A)在感染細胞過程中能被修

4、復。 2．以豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)北美株全長感染性克隆pCBC2為基礎(chǔ)，通過突變PCR獲得在poly(A)中的1、5、10、15位由堿基“A”替換成堿基“G”的全長突變體克隆pC1G、pC5G、pC10G、pC15G，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染MARC-145細胞，觀察細胞病變。對于能產(chǎn)生細胞病變的提取病毒RNA，通過G-Tailing法鑒定其產(chǎn)生的子代病毒基因組RNA中是否含有替換堿基“G”；并且將以上病毒傳代感染MARC-

5、145細胞24h后抽提細胞總RNA，通過5′RACE鑒定該病毒基因組復制中負鏈的起始位點。結(jié)果顯示：pC5G、pc10G、pC15G經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染MARC-145細胞能產(chǎn)生細胞病變；以上三種突變體所產(chǎn)生子代病毒基因組的poly(A)中均不含有替換堿基“G”；PRRSV負鏈在其5′末端含有一段長度不等的poly(U)。 3．本研究旨在對PRRSV基因組中可能的poly(A)加尾信號進行試驗鑒定。以豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV

6、)北美株感染性克隆pCBC2為平臺進行反向遺傳操作，并經(jīng)mRNAMFOLD預測其3′UTR二級結(jié)構(gòu)，在保證二級結(jié)構(gòu)不變的前提下，通過突變PCR獲得PRRSV基因組3′UTR一級序列堿基替換的全長突變體克隆，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染MARC-145細胞，觀察細胞病變(CPE)，對于能產(chǎn)生CPE的，抽提細胞上清中的病毒RNA，通過RT-PCR法鑒定突變病毒。結(jié)果顯示部分3′UTR一級序列堿基替換影響PRRSV基因組的感染性；同時，對可能的幾個加尾信號