食管腺癌患者血液中外排小體微小RNA的研究.pdf

1、背景:食管癌是食管的常見疾病，也是一種常見的腫瘤。在全世界范圍內(nèi)，食管癌造成的死亡人數(shù)占所有癌癥死亡人數(shù)的第六位。食管癌的主要病理類型包括鱗狀細(xì)胞癌和腺癌。食管鱗狀細(xì)胞癌在亞洲國家高發(fā)，從伊朗北部，到中亞，再到中國北部的這一區(qū)域被稱為“亞洲帶”，在這一地區(qū)，食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率高達(dá)十萬分之一百。在西方國家，盡管鱗狀細(xì)胞癌也是食管癌的主要病理類型，但食管腺癌的發(fā)病率在逐年上升。在某些國家例如丹麥，蘇格蘭，食管腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過了食管鱗

2、狀細(xì)胞癌。在中國，隨著人民生活水平的提高，飲食和生活習(xí)慣的改變，肥胖人群的增加，鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率逐漸下降，而食管腺癌的發(fā)病率卻逐漸增高，呈現(xiàn)出與西方國家相似的趨勢。因此，如何早期診斷食管腺癌，已成為醫(yī)療工作者們十分重要的任務(wù)。近年來關(guān)于外排小體的研究，為解決食管腺癌早期診斷的問題提供了一個方向。外排小體是一種廣泛存在于各種動植物體內(nèi)的囊泡狀結(jié)構(gòu)。上世紀(jì)80年代，科學(xué)家在血液中首次注意到了這種物質(zhì)，證明它是一種之前沒有見過的新結(jié)構(gòu)后將其

3、命名為“外排小體”。外排小體來源于細(xì)胞內(nèi)的多泡囊狀體，是細(xì)胞向周圍環(huán)境排出無用蛋白、向其他細(xì)胞傳遞自身結(jié)構(gòu)（如蛋白質(zhì)，RNA等）的重要途徑之一。外排小體在細(xì)胞間的聯(lián)系發(fā)揮著重要的作用，隨著研究的深入，其生理功能也被逐漸揭開。外排小體內(nèi)含多種組成成分，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA等。近年來，關(guān)于外排小體中微小RNA作為一類潛在腫瘤標(biāo)記物的研究逐漸深入，在多種腫瘤如肺癌、卵巢腺癌等均發(fā)現(xiàn)，患者血液中外排小體的微小RNA可能作為其相應(yīng)的腫瘤標(biāo)記物

4、，對早期診斷腫瘤有著巨大的意義。
　　方法:收集食管腺癌患者10例，非癌癥患者10例。由于食管腺癌發(fā)病人群具有顯著的性別差異，男性發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性，因此本研究中所有食管腺癌病人和非癌癥病人均選取男性。在選擇病人時選取癌癥分期較晚（約中晚期或晚期）的患者，以更好地體現(xiàn)癌癥和非癌癥患者血液外排小體中微小RNA譜的差異。為使兩組病人年齡不僅均值相似，年齡分布也匹配，做年齡分布圖以進(jìn)行選擇。簽署知情同意書后采集癌癥病人和非癌癥人群的血液

5、標(biāo)本，為減少血細(xì)胞等物質(zhì)的干擾，將血液標(biāo)本分離為血清和血漿后分別提取血清、血漿外排小體，使用NanoSight和電子顯微鏡對外排小體進(jìn)行計數(shù)和觀察;隨后從這些外排小體中提取總RNA，使用OpenArray對總RNA中的微小RNA進(jìn)行篩查，并采用Statminer，Graphpad Prism和Microsoft Excel等軟件分析數(shù)據(jù)。在Statminer數(shù)據(jù)分析中采用LIMMA和2-△△Ct方法計算在癌癥和非癌癥人群的血清、血漿外排

6、小體中表達(dá)具有顯著性差異的微小RNA，在Excel驗證分析中采用微小RNA相對表達(dá)量和管家基因標(biāo)準(zhǔn)化方法驗證這些顯著差異性表達(dá)的微小RNA，并使用Ingenuity Pathway Analysis對得到的顯著差異性表達(dá)的微小RNA進(jìn)行相關(guān)生理和細(xì)胞功能、生物學(xué)通路的查找，明確它們與腫瘤的關(guān)系。
　　結(jié)果:經(jīng)分析得到，在血清外排小體中提取的總RNA中，10個微小RNA在食管腺癌患者和非癌癥人群中的表達(dá)具有顯著性差異(P＜0.05)

7、: hsa-miR-a, hsa-miR-b, hsa-miR-c, hsa-miR-d, hsa-miR-e,hsa-miR-f，hsa-miR-g，h，hsa-miR-i，hsa-miR-j;在血漿外排小體提取的RNA中，16個微小RNA在食管腺癌患者和非癌癥人群中的表達(dá)具有顯著性差異(P＜0.05):k，l，has-miR-m，hsa-miR-n，hsa-miR-o，hsa-miR-p，hsa-miR-q, hsa-miR-r,

8、hsa-miR-s, hsa-miR-t, hsa-miR-u, hsa-miR-v,hsa-miR-w，x，hsa-miR-i，hsa-mR-j。對這些微小RNA進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)的分析表明它們與很多癌癥相關(guān)的生理功能和細(xì)胞功能有關(guān)，包括:腫瘤形成、生長和增殖，細(xì)胞運動，細(xì)胞增殖和凋亡，胃腸系統(tǒng)疾病，細(xì)胞周期，腫瘤形態(tài)學(xué)，細(xì)胞間信息交換，RNA翻譯后調(diào)節(jié)等等。
　　結(jié)論:食管腺癌患者血液中外排小體的微小RNA是一組十分有潛力的候選腫瘤