白細(xì)胞介素18誘導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎炎癥應(yīng)答和軟骨的降解.pdf

1、研究背景:
　　 骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是中老年人中最常見(jiàn)的疾病。OA的典型病理改變是關(guān)節(jié)軟骨的退變，包括纖維化、軟骨厚度改變、軟骨細(xì)胞排列紊亂和數(shù)量的減少。關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)主要包括蛋白多糖和膠原，OA患者胞外基質(zhì)合成-分解平衡的破壞是引起軟骨降解的重要原因。一些研究表明，IL-1β、IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子能夠抑制聚集蛋白聚糖(aggrecan)的合成，而aggrecan正是軟骨中含量最多

2、的一種蛋白多糖。因而，炎癥因子在OA的發(fā)病中扮演著重要的角色。
　　 IL-18最初被認(rèn)為是IFN-γ的誘導(dǎo)因子，它的結(jié)構(gòu)類(lèi)似于IL-1。正常情況下，Kuffer細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、星形細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、呼吸上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞均能產(chǎn)生無(wú)活性的IL-18前體。像IL-1β一樣，IL-18以無(wú)活性的前體形式合成，在IL-1β轉(zhuǎn)化酶的作用下發(fā)生裂解。氧化應(yīng)激或者蛋白脂多糖刺激半胱天冬酶-1途徑后

3、，成熟IL-18的產(chǎn)生會(huì)大量增加。IL-18誘導(dǎo)Fas配體、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)和一些炎性蛋白的產(chǎn)生。有人報(bào)道IL-18能夠促進(jìn)多種炎癥因子的表達(dá)，如:IFN-γ、粒細(xì)胞集落刺激因子、TNF-α和IL-1β，導(dǎo)致一系列炎性疾病的發(fā)展，如:腸道疾病、特異性皮炎、哮喘、間質(zhì)性肺炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD)等。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，IL-18在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid athr

4、itis，RA)的發(fā)病過(guò)程中有重要的作用。IL-18在RA患者的滑液中表達(dá)增高，同時(shí)，OA患者滑液及滑膜中亦能檢測(cè)到IL-18的受體的表達(dá)，減少滑膜中巨噬細(xì)胞的數(shù)量能夠抑制軟骨的降解和骨贅的形成。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)OA軟骨中亦有IL-18的表達(dá)，IL-18誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。
　　 本題的前期研究證實(shí)，體外培養(yǎng)的OA滑膜細(xì)胞上清液中，IL-18和PGE2的濃度具有相關(guān)性。較正常的滑膜細(xì)胞，OA滑膜細(xì)胞能夠產(chǎn)生高水平的IL-18。然而

5、，IL-18對(duì)滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及膝關(guān)節(jié)退變的影響尚不清楚。本研究旨在探討高濃度IL-18對(duì)軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的促炎作用，以及對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的影響。
　　 目的:
　　 1.觀察IL-18對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響
　　 2.探討重組人IL-18(hrIL-18)對(duì)人軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞炎癥應(yīng)答，以及對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響
　　 3.應(yīng)用重組大鼠IL-18（rrIL-18）初步建立OA動(dòng)物模型，探討IL-18對(duì)膝關(guān)

6、節(jié)軟骨的影響
　　 方法:
　　 1.人OA軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　 取膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)置換術(shù)中取下的股骨髁、脛骨平臺(tái)，在無(wú)菌條件下，以手術(shù)刀片小心切取關(guān)節(jié)面軟骨，將軟骨組織切成0.5-1 mm3的小塊，0.2％的Ⅱ型膠原酶和0.1％的透明質(zhì)酸酶37℃恒溫消化6h。無(wú)菌細(xì)胞篩過(guò)濾，并收集軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25 cm培養(yǎng)瓶，置于37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行原代培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至80％左右，接近融合傳代，第2代之前

7、的細(xì)胞用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、分布及生長(zhǎng)狀態(tài)，采集圖像。收集第1、2代軟骨細(xì)胞接種至96孔板，應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，并繪制生長(zhǎng)曲線。采用免疫組化的方法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原的表達(dá)。
　　 2.人OA滑膜細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 無(wú)菌PBS洗滌滑膜組織兩次，將滑膜組織剪碎，成糊狀。0.1％的胰蛋白酶消化組織30分鐘，含0.1％Ⅰ型膠原酶的培養(yǎng)基消化組織2h。無(wú)菌細(xì)胞篩過(guò)濾，離心，收

8、集細(xì)胞。加入含有10％胎牛血清的培養(yǎng)基和雙抗，進(jìn)行原代細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)。免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)Ⅰ型膠原和VCAM-1的表達(dá)。
　　 3.rhIL-18對(duì)OA軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的影響
　　 (1)rhIL-18對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響
　　 收集軟骨細(xì)胞接種至96孔板，分別加入不同濃度的rhIL-18(0、50、150、300 ng/ml)、50 ng/ml的TGF-β、50 ng/ml IL-18+TGF-β，孵

9、育48 h，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞的增殖。
　　 (2)細(xì)胞干預(yù)和RT-PCR檢測(cè)
　　 軟骨細(xì)胞接種于6孔板中，加入不同濃度rhIL-18(0、50、150、300ng/ml)共同孵育48 h。等量的第1代(G1)、第2代(G2)和第3代(G3)滑膜細(xì)胞在無(wú)血清DMEM中饑餓24 h，加入含IL-18(10mM/ml)的培養(yǎng)基孵育24 h，收集細(xì)胞和上清液。提取細(xì)胞的總RNA，RT-PCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞炎癥因

10、子、Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖以及滑膜細(xì)胞炎癥因子mRNA的表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，分析mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　 (3)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2、TNF-α和MMP-13濃度的測(cè)定
　　 軟骨細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)12h后，加入不同濃度rhIL-18(0、50、150、300 ng/ml)共同孵育48 h。等量的第1代(G1)、第2代(G2)和第3代(G3)滑膜細(xì)胞在無(wú)血清DMEM中饑餓24 h，加入含IL-18(

11、10 mM/ml)的培養(yǎng)基孵育24 h，收集細(xì)胞。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)PGE2、TNF-α和MMP-13的濃度。
　　 (4)RT-PCR方法檢測(cè)軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中IL-18受體的表達(dá)。
　　 4.rrIL-18誘導(dǎo)大鼠膝關(guān)節(jié)退變
　　 (1)分組和干預(yù)
　　 20只SD大鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)注射rrIL-18(200 ng)作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)側(cè)注射等量PBS溶液作為對(duì)照組。6周

12、、12周后，各有一半樣本進(jìn)入指標(biāo)檢測(cè)。
　　 (2)大鼠膝關(guān)節(jié)X線表現(xiàn)
　　 大鼠麻醉后固定于泡沫板上，行雙側(cè)膝關(guān)節(jié)X線檢查。采集圖像，兩名獨(dú)立的觀察者評(píng)價(jià)膝關(guān)節(jié)的退變情況。
　　 (3)膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察
　　 頸椎脫臼法處死大鼠，取膝關(guān)節(jié)作為檢測(cè)樣本。剔除關(guān)節(jié)周?chē)能浗M織，多聚甲醛固定、脫鈣、石蠟包埋、5μm切片后，番紅O/快綠染色。采集切片的圖像后，應(yīng)用IPP軟件計(jì)算兩組樣本軟骨的面積。
　

13、　 (4)脫鈣后的關(guān)節(jié)標(biāo)本行石蠟切片，應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中COX-2和Aggrecan的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.OA軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定
　　 (1)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 原代軟細(xì)胞形狀不規(guī)則，多呈短橢圓形，部分呈星形和多角形。傳3代后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈長(zhǎng)梭形。
　　 (2)軟骨細(xì)胞增殖
　　 隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)目不斷增加（P＜0.01），直到第10d

14、左右進(jìn)入平臺(tái)期。同一時(shí)間，第1、2代細(xì)胞的數(shù)目無(wú)明顯差異(P=0.939)，時(shí)間與代次之間無(wú)明顯的交互作用(P=0.577)。
　　 (3)免疫組化染色
　　 所有細(xì)胞Ⅱ型膠原的免疫組化染色為陽(yáng)性。
　　 2.OA滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定
　　 (1)滑膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 A型滑膜細(xì)胞呈多邊形，B性滑膜細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形。隨著代次增加，B型滑膜細(xì)胞的比例增加。
　　 (2)滑膜細(xì)胞增殖

15、>　　 隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)目不斷增加（P＜0.01），直到第4d左右進(jìn)入平臺(tái)期。同一時(shí)間，第1-3代細(xì)胞的數(shù)目無(wú)明顯差異(P＞0.05)，時(shí)間與代次之間無(wú)顯著的交互作用(P=0.987)。
　　 (3)免疫組化染色和FCM檢測(cè)
　　 所有細(xì)胞Ⅰ型膠原的免疫組化染色為陽(yáng)性，細(xì)胞表面VCMA-1的表陽(yáng)性。
　　 3.rhIL-18誘導(dǎo)炎癥因子的分泌并抑制軟骨基質(zhì)的合成
　　 (1) rhIL-18對(duì)軟骨

16、細(xì)胞增殖的影響
　　 孵育48 h后，不同濃度的rhIL-18（0、50、150和300 ng/ml）對(duì)軟骨細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著影響（P＞0.05）。相比較對(duì)照組，TGF-β+IL-18組和TGF-β組細(xì)胞數(shù)顯著增加(P＜0.001，P=0.016)。TGF-β+IL-18組細(xì)胞數(shù)低于TGF-β組(P=0.002)。
　　 (2) rhIL-18抑制軟骨細(xì)胞產(chǎn)生aggrecan，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)與對(duì)照組相比，300 ng/m

17、l組Aggrecan的表達(dá)顯著降低（P=0.008）。但是，各組細(xì)胞collagenⅡ的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。rhIL-18促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌COX-2和TNF-α，并具有濃度依賴效應(yīng)。300 ng/ml組COX-2 mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（0 ng/ml組）和150 ng/ml組（P=0.006和P=0.036）。與對(duì)照組（0 ng/ml組）相比較，150 ng/ml組和300 ng/ml組TNF-α的mRNA的表達(dá)

18、顯著增高(P=0.001和P=0.023)。IL-18上調(diào)G1滑膜細(xì)胞中COX-2和TNF-α mRNA的表達(dá)。
　　 (3)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2、TNF-α和MMP-13濃度測(cè)定
　　 隨著rhIL-18濃度的增加，上清液中PGE2和TNF-α的含量顯著增加（P＜0.001）。50 ng/ml組PGE2的水平與對(duì)照組（0 ng/ml組）、300 ng/ml組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.001和P=0.001）。150 n

19、g/ml組TNF-α的濃度與對(duì)照組（0 ng/ml組）、300 ng/ml組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001和P=0.001)。然而，在不同濃度rhIL-18干預(yù)下，MMP-13的含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。G1滑膜細(xì)胞中，IL-18組PGE2和TNF-α的濃度顯著高于對(duì)照組(P=0.005，P=0.007)。
　　 4.rrIL-18誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨的基質(zhì)降解和炎癥反應(yīng)
　　 (1)大鼠膝關(guān)節(jié)中IL-18的水平

20、>　　 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組膝關(guān)節(jié)中IL-18的濃度分別為464.64±31.26 pg/ml和15.26±1.62 pg/ml，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.002)。
　　 (2)大鼠膝關(guān)節(jié)X線表現(xiàn)
　　 6周后，實(shí)驗(yàn)組2例膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)關(guān)節(jié)間隙變窄或者骨贅形成，而對(duì)照組僅有1例出現(xiàn)關(guān)節(jié)間隙變窄。兩組退變發(fā)生率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。12周后，實(shí)驗(yàn)組中5個(gè)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)間隙變窄或者骨贅形成，對(duì)照組未見(jiàn)異常膝關(guān)節(jié)改變。兩組

21、退變發(fā)生率有顯著差異(P=0.033)。
　　 (3)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)檢測(cè)
　　 對(duì)照組股骨髁的面積為4.01±1.12 mm2，實(shí)驗(yàn)組股骨髁軟骨的面積為3.45±1.08 mm2。兩組軟骨面積有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，后者顯著減小(P=0.035)。
　　 (4)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨免疫組化檢測(cè)
　　 12周后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組股骨髁軟骨中Aggrecan的表達(dá)量顯著降低(P=0.021)。兩組脛骨平臺(tái)軟骨中

22、，Aggrecan的表達(dá)也有明顯的不同（P=0.047）。無(wú)論是在股骨髁還是脛骨平臺(tái)的軟骨中，實(shí)驗(yàn)組COX-2的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P=0.002，P=0.032）。
　　 結(jié)論:
　　 1.IL-18不影響軟骨細(xì)胞的增殖，但是能夠抑制TGF-β對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。
　　 2.IL-18誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的炎癥應(yīng)答，抑制軟骨基質(zhì)的合成。
　　 3.膝關(guān)節(jié)內(nèi)高水平的IL-18通過(guò)促進(jìn)軟骨分泌炎癥因