大鼠脂肪組織來源干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化以及與絲素材料相容性的初步研究.pdf

1、本課題主要探索大鼠脂肪組織中分離得到間充質(zhì)干細(xì)胞的方法以及其向各方向的分化能力。主要包括六個部分： 一、大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定。 目的：探索從大鼠脂肪組織中分離得到間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，以及對其干細(xì)胞表型的研究，為組織工程提供理想的種子細(xì)胞。 方法：從SD大鼠的附睪處切取脂肪組織，通過消化的方法獲得一群細(xì)胞，在體外完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生物學(xué)特性以及細(xì)胞表面標(biāo)記。 結(jié)果：可以從大鼠附

2、睪的脂肪組織中分離得到一群類成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，可在體外穩(wěn)定擴(kuò)增傳代。免疫熒光組織化學(xué)顯示細(xì)胞表面CD44，Vimentin抗體陽性。 結(jié)論：本試驗方法可成功的從大鼠的脂肪組織中分離得到一群間充質(zhì)干細(xì)胞，并且細(xì)胞表達(dá)CD44，Vimentin細(xì)胞表型，證明其來源于中胚層組織，在體外穩(wěn)定增殖，有希望成為理想的種子細(xì)胞。 二、大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞向成骨方向的誘導(dǎo)分化。 目的：研究從大鼠附睪處脂肪組織中分離得到的間充

3、質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞的成骨特性。 方法：從SD大鼠的附睪處切取脂肪組織，通過消化的方法獲得一群間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外經(jīng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)二十天，觀察并檢測成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性。 結(jié)果：大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞可在成骨條件下誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞，經(jīng)鑒定堿性磷酸酶和礦化結(jié)節(jié)染色陽性。 結(jié)論：大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞可在體外定向誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞。 三、大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞向軟骨方向的誘導(dǎo)分化。 目的：

4、研究從大鼠附睪處脂肪組織中分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性。 方法：從SD大鼠的附睪處切取脂肪組織，通過消化的方法獲得一群間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外經(jīng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)六周，觀察并檢測軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性。 結(jié)果：大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞可在軟骨條件下誘導(dǎo)表達(dá)軟骨細(xì)胞表型，并且能夠分泌蛋白聚糖，隨誘導(dǎo)時間延長，蛋白聚糖的量呈增加趨勢。II型膠原單克隆抗體免疫熒光染色陽性，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)從RNA水平驗證了I

5、I型膠原的表達(dá)。 結(jié)論：大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞可在體外定向誘導(dǎo)表達(dá)軟骨細(xì)胞表型。 四、大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞向成肌方向的誘導(dǎo)分化。 目的：研究從大鼠附睪處脂肪組織中分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外向成肌細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的能力。 方法：從SD大鼠的附睪處切取脂肪組織，通過消化的方法獲得一群間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外經(jīng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)八周，觀察并檢測成肌細(xì)胞的生物學(xué)特性。 結(jié)果：大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞可在軟

6、骨條件下誘導(dǎo)表達(dá)肌肉細(xì)胞表型，Myosin單克隆抗體熒光染色呈陽性；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)從RNA水平驗證了MyoDl和Myosin的表達(dá)。 結(jié)論：大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞在體外經(jīng)誘導(dǎo)具有向成肌細(xì)胞分化的能力。 五、大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的比較研究。 目的：比較大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性以及向多方向誘導(dǎo)分化的能力，為組織工程提供種子細(xì)胞。 方法：通過髓腔沖洗

7、，梯度分離法獲得大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將其生長動力學(xué)以及向成骨、軟骨、成肌細(xì)胞方向分化的能力與大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞進(jìn)行比較。 結(jié)果：大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，生長動力學(xué)以及向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞方向的分化能力無明顯差異。 結(jié)論：大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞生物學(xué)特性與分化能力與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，可作為組織工程理想的種子細(xì)胞。 六、大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞與絲素多孔體的體外相容及體

8、內(nèi)成骨的初步試驗研究。 目的：觀察大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞與絲素材料的體外相容性，為其作為組織工程的種子細(xì)胞提供依據(jù)。 方法：將從SD大鼠的附睪處切取脂肪組織，通過消化的方法獲得一群間充質(zhì)干細(xì)胞，CM標(biāo)記后，種植于絲素材料上，每周在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況。將經(jīng)成骨方向誘導(dǎo)后的細(xì)胞與材料復(fù)合后植入大鼠背部皮下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為陽性對照，空白材料為陰性對照。每周取材，行常規(guī)病理和MMasson染色，觀察其異位