光動力制備的皮膚鱗癌細(xì)胞裂解物對鼠樹突狀細(xì)胞表型及功能成熟的影響.pdf

1、背景：機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的生長有識別、監(jiān)視和預(yù)防的功能,免疫系統(tǒng)啟動對腫瘤細(xì)胞進行殺傷的重要環(huán)節(jié)之一是對腫瘤特異性抗原的識別和攝取,這個復(fù)雜的生理過程中樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)起到了重要的作用。DC是目前所知的功能最強的抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC),因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。正常生理情況下樹突狀細(xì)胞處于未成熟狀態(tài),低表達(dá)MHCⅠ/Ⅱ類分子、黏附分子和

2、共刺激分子,但具有強大的抗原識別吞噬能力。在受到炎癥因子等刺激后樹突狀細(xì)胞分化成熟,抗原遞呈能力增強,將加工處理過的抗原肽-復(fù)合物呈遞給T淋巴細(xì)胞,啟動宿主的抗腫瘤免疫應(yīng)答。近幾年來,利用細(xì)胞因子在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)大量樹突狀細(xì)胞技術(shù)的成熟,使得樹突狀細(xì)胞在腫瘤免疫療法領(lǐng)域逐漸得到發(fā)展應(yīng)用。5-氨基酮戊酸光動力療法(5-amininolevilinic acid-photodynamic therapy,ALA-PDT)是一種新型無創(chuàng)傷性治療

3、腫瘤等疾病的新技術(shù),特別是對皮膚腫瘤疾病不僅可在組織學(xué)上實現(xiàn)逆轉(zhuǎn),而且能在不增加細(xì)胞毒性的情況下預(yù)防皮膚癌前期病變發(fā)生及降低皮膚癌發(fā)生概率。光動力療法作用機制不僅包括直接對腫瘤細(xì)胞殺傷、損傷腫瘤組織脈管系統(tǒng),而且能誘導(dǎo)機體抗腫瘤免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤局部光動力治療可以誘導(dǎo)局部或系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應(yīng),甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶亦可受抑制。研究發(fā)現(xiàn)光動力治療后腫瘤組織中有炎癥細(xì)胞浸潤和TNF-α,IL-1β,IL-6等炎癥介質(zhì)表達(dá)上調(diào),且局部DC、

4、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞明顯增多。不僅如此,文獻報道光動力體外處理腫瘤細(xì)胞的得到的腫瘤細(xì)胞裂解物可作為一種新型的瘤苗對腫瘤起到治療和預(yù)防作用,具體機制可能與細(xì)胞死亡過程中釋放的腫瘤特異性抗原通過誘導(dǎo)DC分化成熟,啟動機體抗腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān),因此光動力誘導(dǎo)特異性抗腫瘤的效應(yīng)逐漸受到了更多的關(guān)注。光動力療法是一種光化學(xué)療法,其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方式與其他療法(如放療、化療)有顯著不同,且不同照光劑量光動力處理引起細(xì)胞的死亡方式(凋亡/壞死

5、)也會有所不同。這種差異是否會影響腫瘤抗原釋放的途徑和程度,使DC不同程度分化成熟,影響DC對抗原的加工和遞呈,最終造成強弱不等的免疫應(yīng)答效應(yīng)?目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)這方面的研究報道,據(jù)此本實驗重點探討于體外光動力處理皮膚鱗癌細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解物是否能對小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞表型及功能成熟的起到免疫調(diào)節(jié)作用,且這種調(diào)節(jié)作用強度是否與照光劑量存在量-效關(guān)系。為進一步提高光動力療法免疫應(yīng)答效應(yīng)提供新的理論基礎(chǔ)。
　　目的：通過觀察小鼠骨

6、髓來源的樹突狀細(xì)胞表型及功能變化,對光動力制備的皮膚鱗癌細(xì)胞裂解物影響DC免疫學(xué)效應(yīng)進行研究。包括(1)不同照光劑量光動力處理的腫瘤細(xì)胞制備腫瘤細(xì)胞裂解物;(2)樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)、分離培養(yǎng)及鑒定;(3)觀察細(xì)胞裂解物對樹突狀細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)變化影響。
　　方法：(1)選擇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死狀態(tài)下不同照光劑量光動力處理腫瘤細(xì)胞:選擇小鼠皮膚鱗癌細(xì)胞株P(guān)ECA,將PECA細(xì)胞與不同的濃度(0.1 mM,0.5 mM,1 mM,5 mM

7、,10 mM)ALA無血清培養(yǎng)基避光條件下共孵育,于孵育1 h,2 h,3 h,4 h,5h,6 h,8 h,10h,12 h,14 h,16 h,18 h,20 h,22 h,24 h后,測定生成的PpⅨ熒光強度。以PpⅨ熒光強度最強的點為最佳ALA濃度及孵育時間。在此基礎(chǔ)上,以不同的照光劑量(0 J/cm2、5 J/cm2、1 J/cm2、2 J/cm2)ALA-PDT處理皮膚鱗癌細(xì)胞株P(guān)ECA,采用Hoechst/PI染色及流式細(xì)

8、胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的死亡方式。(2)樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定:于細(xì)胞因子IL-4、GM-CSF聯(lián)合使用于體外分離誘導(dǎo)小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC),在倒置顯微鏡下每天觀察細(xì)胞的生長情況,描述細(xì)胞的形態(tài)變化;在培養(yǎng)7天后分別采用透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope,TEM)、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM)觀察細(xì)胞的形

9、態(tài);并利用抗小鼠 CD11c-PE抗體標(biāo)記DC,流式細(xì)胞術(shù)鑒定DC純度。(3)分析光動力制備的細(xì)胞裂解物對DC免疫學(xué)指標(biāo)變化的影響:將制備的光動力細(xì)胞裂解物與樹突狀細(xì)胞共孵育24小時后,將DC細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)上清取出。分別采用ELISA法檢測上清中DC分泌的IL-12、INF-γ、IL-10等細(xì)胞因子變化;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面標(biāo)志分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86等表達(dá)變化。最后采用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte

10、 reaction,MLR)觀察DC體外對T淋巴細(xì)胞增殖作用的影響。
　　結(jié)果：(1)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死狀態(tài)下不同照光劑量的確定:將 PECA細(xì)胞與不同的濃度(0.1 mM,0.5 mM,1 mM,5 mM,10 mM)ALA無血清培養(yǎng)基避光條件下共孵育,于孵育1 h,2 h,3 h,4 h,5h,6 h,8 h,10h,12 h,14 h,16 h,18 h,20 h,22 h,24 h后,測定生成的PpⅨ熒光強度,選取0.5

11、mM ALA及5小時孵育時間為最佳組合。采用0 J/cm2、0.5 J/cm2、1 J/cm2、2 J/cm2不同劑量進行照射后,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率分別為1.5％、28.0%、11.9%、1.8%;壞死率分別為0.2%、1.0%、11.9%、34.8%。Hoechst/PI染色1.2%、30%、12%、2%。根據(jù)實驗結(jié)果確定0.5 J/cm2照光劑量為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡狀態(tài)的最佳劑量,2 J/cm2照光劑量為誘導(dǎo)細(xì)胞壞死狀態(tài)的最佳劑量。

12、(2)小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞分離誘導(dǎo)及鑒定結(jié)果:經(jīng)細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用體外分離誘導(dǎo),原代培養(yǎng)小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定特殊表面標(biāo)記CD11c-PE,純度為80%左右。利用倒置相差顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并記錄。(3)樹突狀細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)變化;不同光動力劑量處理的腫瘤細(xì)胞與DC共培養(yǎng)24小時后,ELISA檢測不同劑量、不同時間點細(xì)胞裂解物與 DC共培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子INF-γ、IL-12、IL-10分泌量的變化

13、。結(jié)果顯示光動力處理細(xì)胞裂解物對DC致敏后,各組細(xì)胞因子釋放量高于未致敏 DC組;0.5 J/cm2光動力劑量下分泌的細(xì)胞因子的量普遍最高,而2 J/cm2光動力劑量下分泌的細(xì)胞因子的量普遍最低;各個劑量下處理6小時細(xì)胞因子分泌量均為最高峰,其中在0.5 J/cm2光動力劑量下處理6小時后的細(xì)胞裂解物刺激DC釋放到上清的各個細(xì)胞因子的分泌量為最高。在此基礎(chǔ)上,我們重點研究0.5 J/cm2光動力劑量處理的細(xì)胞裂解物致敏DC后,流式細(xì)胞術(shù)

14、鑒定DC表面標(biāo)記性分子的表達(dá)變化,其中細(xì)胞裂解物致敏DC組CD80、CD86、MHC-Ⅱ表達(dá)量均增加,增加的表達(dá)量小于LPS刺激DC組?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)研究光動力處理細(xì)胞裂解物致敏樹突狀細(xì)胞體外對同種異型 T淋巴細(xì)胞的增殖作用,分別以0.5 J/cm2光動力劑量下處理3h,6h,9h,12h,24h細(xì)胞裂解物致敏的DC,再與同種異型T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),觀察DC對T細(xì)胞的刺激指數(shù),其中6h組刺激增殖能力明顯高于3h、9h,12h,24h組,