胰液中相關(guān)基因高甲基化檢測在胰腺疾病診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、胰腺癌是二十一世紀(jì)人類面臨的高度惡性腫瘤之一。與胃結(jié)腸腫瘤不同，因胰腺的解剖結(jié)構(gòu)特點，對胰腺腫瘤活檢病理診斷比較困難。胰液的細(xì)胞學(xué)診斷曾被用于胰腺癌的診斷，但在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上區(qū)分腫瘤細(xì)胞或炎癥細(xì)胞亦比較困難，其準(zhǔn)確性較低。胰液與血清相比含有高濃度的胰腺癌釋放的DNA和蛋白質(zhì)，被視為分子標(biāo)志物的可靠來源，通過檢測胰液中可能存在的分子生物學(xué)標(biāo)志物用于胰腺癌輔助診斷越來越受到重視。因此尋找并檢出可能存在于胰液、胰腺灌洗液和十二指腸液中的特異性腫

2、瘤標(biāo)志物可能對胰腺癌診斷具有重要的臨床意義。 本研究擬采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MSP)和實時定量MSP方法，在定性診斷的同時應(yīng)用定量方法評價NPTX2、CLDN5、ppENK基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化在胰腺疾病鑒別診斷中的臨床應(yīng)用價值。 材料與方法： 一、人胰腺癌細(xì)胞系9株人胰腺癌細(xì)胞系KLM1，MiaPaCa2，Panc1，PK45H，PK59，PK1，PK8，PK9，BxPC3被用于本研究，分別生長

3、于含1O％胎牛血清的PRMI1640和DMEM培養(yǎng)液中，在37℃5％CO飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)傳代。 二、臨床標(biāo)本 臨床標(biāo)本來自日本金澤大學(xué)腫瘤研究所腫瘤內(nèi)科1995-2005年住院患者共80例。其中，胰腺癌(PCa)37例，男性28例，女性9例，年齡范圍從32歲到86歲；慢性胰腺炎(CP)25例，男性16例，女性9例，年齡范圍從29歲到76歲；胰管內(nèi)乳頭狀粘液瘤(IPMN)18例，男性12例，女性6例，年齡范圍從54歲到79

4、歲。胰腺癌病例中腫瘤位于胰頭部18例，體尾部19例。16例經(jīng)術(shù)后病理或超聲內(nèi)鏡活檢病理診斷為胰腺癌，21例經(jīng)超聲、超聲內(nèi)鏡、CT、ERCP、腫瘤標(biāo)志物等檢查并經(jīng)診斷為胰腺癌，并在診斷后3～30個月后因胰腺癌死亡。TNM分期根據(jù)1997年第5版UICC分期標(biāo)準(zhǔn)。Ⅰ期2例，Ⅱ期1例，Ⅲ期8例，Ⅳ期26例。腫瘤大小劃分根據(jù)日本胰臟學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)(1996)，TS1(腫瘤直徑≤2cm)4例，TS2(2cm<腫瘤直徑≤4cm)15例，TS3(4cm<腫

5、瘤直徑≤6cm)15例，TS4(6cm<,腫瘤直徑)3例。根據(jù)the Armed Forces Institute of Pathology標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)多種臨床檢查或經(jīng)術(shù)后病理檢查，18例患者被診斷為IPMN，并進(jìn)一步分為良性組和惡性組。其中，惡性組至少滿足下列條件之一：1)主胰管的直徑大于7mm；2)囊性結(jié)節(jié)30mm；3)囊壁結(jié)節(jié)大于6mm；4)交界性病變或腺癌未經(jīng)外科術(shù)后病理證實。良性組為未滿足上述條件的病變，或者術(shù)后病理證實為不典型增

6、生和腺瘤。按上述標(biāo)準(zhǔn)，10例患者被診斷為惡性組，8例被診斷為良性組。根據(jù)日本胰臟學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)(1997)，25例患者被診斷為胰腺炎，并經(jīng)12個月隨訪未發(fā)現(xiàn)胰腺新生腫瘤。 三、標(biāo)本收集及提取基因組DNA在內(nèi)窺鏡逆行胰膽管造影(ERCP)檢查的同時收集患者胰液約10ml，-80℃保存?zhèn)溆谩?四、MSP (一)DNA處理取約1μg胰液基因組DNA，65℃重亞硫酸鹽處理12-16hs(CpGennome DNA Modifi

7、cation Kit，Intergen，USA)處理基因組DNA(具體方法按說明操作)，保存于-80℃?zhèn)溆谩?(二)PCR 分別使用基因NPTX2、CLDN5、ppENK各自甲基化和非甲基化對應(yīng)引物行PCR擴(kuò)增。 (三)電泳 PCR產(chǎn)物10μl 3％瓊脂糖凝膠電泳，SYBR Gold核酸染料，紫外燈下照相。 五、實時定量MSP (一)實時定量MSP分別使用基因NPTX2、CLDN5、ppE

8、NK各自甲基化和非甲基化對應(yīng)引物行實時定量PCR擴(kuò)增，MYOD1基因作為管家基因用于本研究，NPTX2引物為自行設(shè)計。 (二)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解曲線采用特異性MSP產(chǎn)物cDNA作梯度稀釋，稀釋倍數(shù)10<'5>～10<'9>，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。 六、統(tǒng)計學(xué)分析計數(shù)資料應(yīng)用SPSS11.0軟件行x<'2>檢驗或Fisher精確概率法，P<0.05差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 一、胰腺癌細(xì)胞系CLDN5、NPTX

9、2和ppENK基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化檢測 MSP方法證實9株胰腺癌細(xì)胞系中均普遍存在CLDN5、NPTX2和ppENK啟動子區(qū)CpG島存在高甲基化。其中，KLM1和PK8胰腺癌細(xì)胞系NPTX2啟動子區(qū)CpG島表現(xiàn)為不完全的甲基化；KLM1和PK45H胰腺癌細(xì)胞系CLDN5啟動子區(qū)CpG島表現(xiàn)為不完全的甲基化： KIM1、Pane1和BxPC3胰腺癌細(xì)胞系ppENK啟動子區(qū)CpG島表現(xiàn)為不完全的甲基化，空白對照組(蒸餾水)均

10、為陰性。證實CLDN5、NPTX2和ppENK基因啟動子區(qū)高甲基化廣泛存在于胰腺癌細(xì)胞系中，部分胰腺癌細(xì)胞系表現(xiàn)為不完全甲基化。 二、胰液中CLDN5、NPTX2和ppENK基因CpG島高甲基化檢測 MSP方法證實，在37例胰腺癌患者的胰液中，分別有23例、27例、18例表現(xiàn)為NPTX2、CLDN5、ppENK基因CpG島高甲基化陽性。 三、胰腺癌患者胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK基因啟動子區(qū)CpG島高

11、甲基化與胰腺癌部位、大小和TNM期間的關(guān)系 胰腺癌患者胰液中CLDN5基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化胰頭與胰體尾比差異顯著(P=0.003)。NPTX2、ppENK基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化與胰腺癌部位、大小和TNM期間無明顯相關(guān)(P>0.05)。說明上述三基因高甲基化陽性結(jié)果可能僅提示患胰腺癌，與胰腺癌的病理生物學(xué)行為無明顯相關(guān)。 四、實時定量MSP方法構(gòu)建NPTX2、CLDN5、ppENK基因高甲基化產(chǎn)物溶解曲線分析

12、實時定量MSP方法構(gòu)建NPTX2、CLDN5、ppENK、MYOD1溶解曲線：NPTX2的Tm值約84.3℃；CLDN5的Tm值約85.3℃；ppENK的Tm值約88.5℃；MYOD1的Tm值約80.0℃，根據(jù)特異性產(chǎn)物溶解曲線Tm值，排除可能干擾結(jié)果判定的非特異性的PCR產(chǎn)物，可提高PCR的特異性。 五、實時定量MSP方法檢測胰液中CLDN5、NPTX2和ppENK基因CpG島高甲基化 通過實時定量MSP方法，構(gòu)建特

13、異性PCR產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步定量各標(biāo)本相關(guān)基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化量。 結(jié)論： 一、MSP方法檢測胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化作為胰腺癌腫瘤標(biāo)志物特異性及敏感性均較高，可用于臨床輔助診斷良惡性胰腺疾病。 二、MSP方法檢測胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化提示三基因不同程度參與胰腺癌進(jìn)程。 三、MSP方法檢測N

14、PTX2、CLDN5、ppENK基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化對早期胰腺癌的輔助診斷可能具有較高的臨床應(yīng)用價值。 四、實時定量MSP方法檢測胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化敏感性、特異性均較高，可作為臨床診斷胰腺癌的輔助手段。 五、實時定量MSP方法證實NPTX2、CLDN5、ppENK基因不同水平的啟動子區(qū)CpG島高甲基化可能是胰腺癌進(jìn)程中的重要表觀遺傳學(xué)機(jī)制。 六、應(yīng)用實時定