環(huán)氧氯丙烷處理對去細(xì)胞支架材料降解影響的研究.pdf

1、心臟瓣膜病是威脅人類健康的常見疾病，瓣膜置換是治療的主要方法。 現(xiàn)有的的人造心臟瓣膜存在著缺陷：機(jī)械瓣膜術(shù)后需要終身抗凝,容易發(fā)生出血及血栓栓塞并發(fā)癥；生物辦由于組織退行性變、鈣化而導(dǎo)致瓣膜衰壞和功能障礙。因此，具有生長能力和修復(fù)功能的組織工程心臟瓣膜（tissueengineered heart valve ，TEHV）成為研究的方向和熱點(diǎn)。 組織工程學(xué)是一門近年來迅猛發(fā)展的交叉學(xué)科，運(yùn)用組織工程學(xué)基本原理構(gòu)建的TE

2、HV 理論上能克服機(jī)械瓣膜和生物瓣膜的不足,具有生長性，不需抗凝、不易退行性變且來源充足等優(yōu)點(diǎn)，因而具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。但這只是問題的一個(gè)方面。另一方面在構(gòu)建組織工程心臟瓣膜時(shí)，種子細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和瓣膜支架材料的降解、重塑過程中，還可能出現(xiàn)創(chuàng)傷、缺氧及營養(yǎng)缺乏等種種非生理環(huán)境，均有可能導(dǎo)致鈣化形成，最終導(dǎo)致組織工程心臟瓣膜的衰敗。瓣膜的鈣化不單純是一個(gè)被動(dòng)過程，瓣膜鈣化從細(xì)胞開始，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（Valve interstitial

3、 cells， VICs）、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellula rmatrix，ECM）以及細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等都參與了這一過程，特別是ECM 的代謝和結(jié)構(gòu)功能重塑是這一過程的核心環(huán)節(jié)。其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)目前尚不清楚。本課題擬通過研究環(huán)氧氯丙烷（epoxy chloropropane，EC）處理對ECM 代謝的影響以及對ECM -cell 相互作用的影響，深入研究EC 烷處理生物瓣膜防鈣化的機(jī)制，并進(jìn)一步研究EC 處理對TEHV 去細(xì)胞支

4、架的作用以及對種子細(xì)胞種植的影響，探究環(huán)氧氯丙烷處理去細(xì)胞支架構(gòu)建防鈣化組織工程瓣的可行性。 第一部分：環(huán)氧氯丙烷處理去細(xì)胞支架的理化性能及生物相容性研究。 采用胰酶消化和高滲、低滲性去垢劑Triton X-100 漂洗的方法獲取去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣（APAV），分別用戊二醛（glutaraldehyde，GA）、EC 處理APAV，比較三者在理化性能、細(xì)胞相容性上的差異。結(jié)果顯示：1、經(jīng)EC 處理后，APAV 在力學(xué)、熱

5、皺縮溫度、體外抗酶解能力上明顯優(yōu)于單純APAV。2、經(jīng)EC 處理的APAV 細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞在瓣膜表面生長良好，與單純APAV 相比，沒有改變?nèi)ゼ?xì)胞瓣良好的細(xì)胞相容性，與GA 處理相比，差異顯著。3、血漿蛋白及血小板黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與單純的APAV 相比，經(jīng)EC 處理后的APAV 沒有改變?nèi)ゼ?xì)胞瓣良好的組織相容性，明顯優(yōu)于GA 組。本研究結(jié)果提示經(jīng)EC 處理后APAV 明顯改善了其理化機(jī)械性能，且保持了良好的生物相容性。

6、第二部分：環(huán)氧氯丙烷處理膠原對膠原降解代謝影響的研究。 通過對人成纖維細(xì)胞在EC 處理的膠原膜上種植生長的初步觀察，了解EC 對膠原降解的影響。按不同方法處理的膠原膜分組：單純膠原組（Con 組）、EC 處理組（EC 組）、GA 處理組（GA 組）。將人成纖維細(xì)胞（fibroblasts，F(xiàn)bs）通過靜態(tài)種植方法分別種植在不同的膠原膜上，培養(yǎng)7 天，經(jīng)形態(tài)學(xué)檢測、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription p

7、olymerase chain RT-PCR），觀察人成纖維細(xì)胞的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases ,MMPs)在mRNA 水平、蛋白水平上的表達(dá)。結(jié)果顯示： EC 組膠原表面種植細(xì)胞均勻覆蓋，細(xì)胞生長良好，呈梭形、扁平星形，折光良好。電鏡下見多層細(xì)胞鋪滿，彼此之間形成較多縫隙連接，細(xì)胞表面有微絨毛突起；GA 組膠原表面細(xì)胞稀疏生長，呈梭形、扁平星形，折光度減低電鏡下見膠原表面，有細(xì)胞

8、覆蓋，彼此之間少量縫隙連接，細(xì)胞表面微絨毛較少。人成纖維細(xì)胞MMPs的分泌表達(dá)，EC 組較GA 組明顯減低，兩組表達(dá)差異顯著（p<0.05），EC 組較單純?nèi)ゼ?xì)胞組相比，無明顯差別。本研究結(jié)果提示EC 處理可以減少在EC處理的膠原上生長的人成纖維細(xì)胞MMPs 的分泌，延緩膠原的降解。 第三部分：環(huán)氧氯丙烷處理對去細(xì)胞支架生物學(xué)性狀及降解代影響的實(shí)驗(yàn)研究。 對比研究人成纖維細(xì)胞在EC 和GA 處理的APAV 上種植，培養(yǎng)

9、后的生長情況及MMPs 的分泌表達(dá)。按不同方法處理的APAV 分組：單純APAV組（Con 組）、EC 處理組（EC 組）、GA 處理組（GA 組）。將人Fbs 通過靜態(tài)種植方法分別種植在不同處理的APAV 上，培養(yǎng)7 天，經(jīng)形態(tài)學(xué)檢測、RT-PCR，Western blotting，免疫組化方法，觀察人Fbs 的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)、MMPs 在mRNA 水平、蛋白水平上的表達(dá)。結(jié)果顯示： EC 組APAV 表面種植細(xì)胞均勻覆蓋，細(xì)胞生長

10、良好，呈梭形、扁平星形，折光良好。電鏡下見多層細(xì)胞鋪滿，彼此之間形成較多縫隙連接，細(xì)胞表面有微絨毛突起；GA組APAV 表面細(xì)胞稀疏生長，呈梭形、扁平星形，折光度減低，電鏡下見APAV表面，有細(xì)胞覆蓋，彼此之間少量縫隙連接，細(xì)胞表面微絨毛較少。人成纖維細(xì)胞MMPs 的分泌表達(dá)，EC 組較GA 組明顯減低，兩組表達(dá)差異顯著（p<0.05），EC 組較單純?nèi)ゼ?xì)胞組相比，無明顯差別。 本研究結(jié)果提示EC處理可以降低人成纖維細(xì)胞MMP