Caveolin-1對(duì)人乳腺癌BT474細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及雌激素介導(dǎo)的自噬與凋亡的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：研究caveolin-1對(duì)人乳腺癌BT474細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的作用及其機(jī)制以及對(duì)雌激素介導(dǎo)的BT474細(xì)胞的自噬和凋亡調(diào)控作用及其機(jī)制，探討caveolin-1在人乳腺癌細(xì)胞中是否并非僅僅作為抑癌因子，也有作為原癌因子而發(fā)揮作用的情況。
　　方法：第一部分：我們通過(guò)熒光定量realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)人乳腺癌三種細(xì)胞系BT474、MCF7、SK-BR-3中的caveolin-1 mRNA的表達(dá)水平；使用小分子干

2、擾RNA(siRNA)技術(shù)基因敲除高表達(dá)caveolin-1的BT474細(xì)胞及少量表達(dá)caveolin-1的MCF-7細(xì)胞中的caveolin-1;Realtime-PCR、western blot、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)siRNA敲除caveolin-1的效率;使用CCK-8法、transwell小室、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流失細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA分別敲除BT474、MCF-7細(xì)胞的caveolin-1后對(duì)其細(xì)胞的增殖以及對(duì)DOX的耐藥作用、細(xì)

3、胞的遷移及侵襲能力、克隆形成效率及細(xì)胞周期的作用；然后使用western blot法檢測(cè)siRNA敲除BT474細(xì)胞的caveolin-1后對(duì)其細(xì)胞中的ERK1/2分子信號(hào)通路、基質(zhì)金屬蛋白酶-1、-2、-9(MMP-1、MMP-2、MMP-9)、以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白c-Fos、cyclin D1、β-catenin，還有對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志物E-cadherin、β-catenin的蛋白水平表達(dá)的影響。
　　第二部分：我

4、們通過(guò)使用CCK-8、transwell小室法檢測(cè)雌二醇(E2)對(duì)BT474細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的作用以及siRNA敲除BT474細(xì)胞中的caveoin-1之后對(duì)此作用的影響；接著使用western blot法檢測(cè)E2對(duì)BT474細(xì)胞中的caveolin-1、HMGB1、自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白(LC3Ⅱ、Atg12/5、Beclin-1)蛋白水平表達(dá)的作用以及siRNA分別敲除BT474細(xì)胞的caveolin-1、HMGB1后對(duì)E2的此

5、種作用的影響；采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)BT474細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3融合蛋白的表達(dá)以及E2、caveolin-1 siRNA、HMGB1 siRNA對(duì)LC3融合蛋白形成的作用。我們使用MDC染色法來(lái)檢測(cè)BT474細(xì)胞中自噬小體的形成以及E2、caveolin-1及HMGB1的siRNA對(duì)此自噬小體的形成的影響。最后我們使用流式細(xì)胞儀檢測(cè) E2以及使用siRNA基因敲除caveolin-1、HMGB1后對(duì)BT474細(xì)胞凋亡率的作用；同

6、時(shí)采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)上述干預(yù)作用對(duì)BT474細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)中cleaved-caspase3凋亡小體形成的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)自三次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05視作具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：第一部分：在三種人乳腺癌細(xì)胞株BT474、MCF7、SK-BR-3中，BT474細(xì)胞中的caveolin-1 mRNA的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在MCF7、SK-BR-3細(xì)胞中的表達(dá)水平。使用siRNA技

7、術(shù)在基因水平上對(duì)BT474及MCF-7細(xì)胞中的caveolin-1的敲除效率均可達(dá)60％以上，而caveolin-1的蛋白水平表達(dá)抑制率可達(dá)50％以上。siRNA敲除BT474細(xì)胞中的caveolin-1，其細(xì)胞增殖以及對(duì)DOX的耐藥程度、遷移和侵襲能力、克隆形成效率明顯低于對(duì)照組水平。與對(duì)照組相比，siRNA敲除BT474細(xì)胞的caveolin-1降低了其細(xì)胞中的S期細(xì)胞群的比例，同時(shí)增加了G0/G1期細(xì)胞群比例。而在MCF-7細(xì)胞中

8、，siRNA敲除其caveolin-1表達(dá)則可促進(jìn)其細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并降低G0/G1期細(xì)胞群、增加S期細(xì)胞群的比例，促進(jìn)克隆形成，但對(duì)DOX的耐藥性無(wú)明顯作用。在對(duì)BT474細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子通路及與增殖、遷移、侵襲相關(guān)的蛋白的表達(dá)作用方面，其細(xì)胞內(nèi)的caveolin-1被敲除后，胞內(nèi)的ERK1/2通路的磷酸化程度受到抑制，金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-1、-2、-9的蛋白表達(dá)水平以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、c-Fos、β-ca

9、tenin的表達(dá)水平下降，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)則升高。
　　第二部分：CCK-8法、Transwell小室的檢測(cè)結(jié)果表明siRNA敲除BT474細(xì)胞的caveolin-1可以降低E2誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，同時(shí)也可以降低E2促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲能力的程度。Western blot的檢測(cè)結(jié)果表明，E2可以促進(jìn)BT474細(xì)胞中caveolin-1的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)也促進(jìn)HMGB1、自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白

10、(LC3-Ⅱ、Atg12/5、Beclin-1)的蛋白表達(dá)水平。對(duì)LC3融合蛋白的免疫熒光檢測(cè)及對(duì)自噬小體形成的MDC染色法檢測(cè)結(jié)果表明，E2組中BT474細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的LC3融合蛋白、自噬小體形成的比例與對(duì)照組相比明顯升高。同時(shí)，流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果表明E2還可以抑制BT474細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率，而免疫熒光法檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)cleaved-caspase3的表達(dá)水平的結(jié)果表明E2可以降低BT474細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)cleaved-caspase3的表達(dá)

11、水平。Western blot、免疫熒光、MDC法流式細(xì)胞儀的結(jié)果還表明，siRNA敲除BT474細(xì)胞中的caveolin-1可以減少E2誘導(dǎo)的HMGB1、LC3-Ⅱ、Atg12/5的蛋白表達(dá)升高的程度，同時(shí)E2誘導(dǎo)的LC3融合蛋白以及自噬體的表達(dá)比例也明顯下降。此外，流式細(xì)胞儀、免疫熒光的結(jié)果表明 siRNA敲除BT474細(xì)胞的caveolin-1還能夠促進(jìn)其細(xì)胞的凋亡，以及claeved-caspase3的表達(dá)。最后，siRNA敲除

12、BT474細(xì)胞的HMGB1也可以降低E2誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ的表達(dá)，同時(shí)降低胞質(zhì)內(nèi)LC3融合蛋白、自噬體的形成并能夠促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，增加胞質(zhì)cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論：與在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的抑癌作用不同，caveolin-1在BT474細(xì)胞中表現(xiàn)為原癌作用。使用siRNA抑制BT474細(xì)胞內(nèi)caveolin-1的表達(dá)后可以有效抑制其細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲能力。這些抑制作用是與細(xì)胞內(nèi)的分子信號(hào)通路

13、及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的變化密切相關(guān)的。Caveolin-1還與E2誘導(dǎo)的促BT474細(xì)胞增殖作用密切相關(guān)。Caveolin-1通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡，參與到E2誘導(dǎo)的促細(xì)胞增殖的過(guò)程中。我們的研究結(jié)果表明，caveolin-1在乳腺癌細(xì)胞中并非僅僅存在作為抑癌因子的情況，它還可以作為原癌因子發(fā)揮作用，并且在E2調(diào)控的自噬和凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。因此，對(duì)于caveolin-1在乳腺癌細(xì)胞中的作用及其機(jī)制，仍需進(jìn)一步的研究，才