外周血foxp3基因特異性甲基化區(qū)域甲基化水平檢測(cè)：可作為自身免疫病與慢性感染患者病情評(píng)估潛在的標(biāo)記物.pdf

1、背景:自身免疫疾病是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。系統(tǒng)性紅斑狼瘡和銀屑病均為自身免疫性疾病，前者可累及全身多系統(tǒng)，而后者主要累及皮膚。慢性皮膚感染主要為細(xì)菌、病毒、真菌感染引起的以皮膚黏膜病變?yōu)橹鞯囊活?lèi)疾病。
　　調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatoryT cells，Tregs）是能夠抑制免疫反應(yīng)的細(xì)胞群，在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反應(yīng)和維持機(jī)體免疫平衡方面發(fā)揮重要的作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能失調(diào)與

2、人類(lèi)多種重大疾病，如自身免疫性疾病、感染性疾病、過(guò)敏性疾病、惡性腫瘤、移植排斥的發(fā)生、發(fā)展及治療都密切相關(guān)。FOXP3是叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個(gè)成員，它是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的標(biāo)志性分子。FOXP3基因突變能引起嚴(yán)重的自身免疫性疾病，因此Foxp3在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫自穩(wěn)中起關(guān)鍵作用。FOXP3作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過(guò)直接調(diào)控多種基因來(lái)調(diào)節(jié)Treg的活性。
　　表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)了可遺傳

3、的變化的一門(mén)遺傳學(xué)分支學(xué)科。表觀遺傳的現(xiàn)象很多，已知的有DNA甲基化(DNA methylation)，基因組印記（genomic impriting），母體效應(yīng)(maternal effects)，基因沉默(gene silencing)，核仁顯性，休眠轉(zhuǎn)座子激活和RNA編輯(RNAediting)等。
　　FOXP3基因中TSDR是一段高度保守的富含CpG位點(diǎn)的區(qū)域，在自然Treg中這段區(qū)域是完全去甲基化，但非Treg T細(xì)胞

4、中則是完全甲基化的。
　　高分辨率熔解（簡(jiǎn)稱(chēng)HRM）分析是一門(mén)新興的技術(shù)。它僅僅通過(guò)PCR之后的熔解曲線分析，就能檢測(cè)PCR片段的微小序列差異，從而應(yīng)用在突變掃描、序列配對(duì)和基因分型等多個(gè)方面。憑借其速度和簡(jiǎn)便性，高分辨率熔解這種方法正在迅速普及。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于采用高分辨率溶解曲線分析技術(shù)檢測(cè)上述疾病foxp3基因TSDR區(qū)域甲基化狀態(tài)的相關(guān)資料。
　　目的:此研究采用高分辨率溶解曲線分析技術(shù)檢測(cè)自身免疫病與慢性感染患者

5、foxp3基因TSDR區(qū)域甲基化狀態(tài)，以探討FOXP3基因TSDR區(qū)域甲基化對(duì)天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響，同時(shí)觀察FOXP3基因TSDR甲基化水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)性的相關(guān)性。
　　方法:從65例系統(tǒng)性紅斑狼瘡（包括狼瘡活動(dòng)期與非活動(dòng)期患者）、30例銀屑病、30例慢性皮膚感染（痤瘡、甲真菌病、生殖器皰疹和單純皰疹）患者以及23例健康人中抽取靜脈血200ul，提取基因組DNA，重亞硫酸鹽處理未發(fā)生甲基化的胞嘧啶，然后在rotorg

6、ene-6000儀器上進(jìn)行高分辨率溶解曲線-PCR以檢測(cè)溶解溫度。
　　結(jié)果:與其它各組比較，活動(dòng)期SLE患者溶解溫度最高（溶解溫度越高代表甲基化水平越高，反之亦然），且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與非活動(dòng)性SLE組比較，銀屑病組溶解溫度較高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與健康組比較，銀屑病組溶解溫度較高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。非活動(dòng)性SLE與健康人比較，溶解溫度無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SLE活動(dòng)性與溶解溫度呈明顯正相關(guān)。另外，慢性感染組與健康組比較，溶解溫度更低，具

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　討論:Foxp3是Treg發(fā)育過(guò)程中的主要調(diào)控者，其表達(dá)直接影響體內(nèi)Treg水平。因此，F(xiàn)oxp3的高表達(dá)與體內(nèi)Treg的高水平相關(guān)，反之亦然。Foxp3基因中TSDR是一段高度保守的富含CpG位點(diǎn)的區(qū)域，在自然Treg中這段區(qū)域是完全去甲基化，但非Treg T細(xì)胞中則是完全甲基化的。TSDR的去甲基化與foxp3的穩(wěn)定表達(dá)相關(guān)，而TSDR的甲基化則可以降低foxp3的轉(zhuǎn)錄活性。現(xiàn)已證實(shí)通過(guò)PCR及其他DNA甲

8、基化分析方法來(lái)檢測(cè)foxp3中TSDR甲基化狀態(tài)是一種能監(jiān)測(cè)和定量外周血及組織中Treg含量的可靠方法。Foxp3中TSDR處于非甲基化狀態(tài)時(shí)，能夠通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子如CREB和ATF，進(jìn)而促進(jìn)啟動(dòng)子活性。另外，通過(guò)比較Treg及非Treg T細(xì)胞中foxp3 TSDR組蛋白H3、H4乙?；桨l(fā)現(xiàn)組蛋白H3、H4乙酰化使foxp3穩(wěn)定表達(dá)。
　　在此研究中，通過(guò)運(yùn)用HRM-PCR法，以自身免疫性疾病患者及慢性皮膚微生物感染患者為研

9、究對(duì)象，分析其外周血分離的全基因組DNA中foxp3 TSDR甲基化水平。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性SLE患者及銀屑病患者的foxp3 TSDR甲基化水平明顯高于正常對(duì)照及非活動(dòng)性SLE患者。在之前的一些研究中已經(jīng)證實(shí)活動(dòng)性SLE患者及銀屑病患者體內(nèi)foxp3 TSDR的高甲基化能導(dǎo)致foxp3表達(dá)降低進(jìn)而降低外周血中Treg水平。與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)foxp3TSDR的甲基化水平在活動(dòng)性SLE患者和銀屑病患者之間也有明顯的差異，具體表現(xiàn)為活動(dòng)

10、性SLE患者的溶解溫度更高，進(jìn)而甲基化程度更高。也發(fā)現(xiàn)在SLE患者中，疾病的活動(dòng)度和嚴(yán)重程度直接與foxp3 TSDR的甲基化水平相關(guān)。另一方面，發(fā)現(xiàn)慢性皮膚微生物感染患者的溶解溫度與正常對(duì)照相比降低，表示其foxp3TSDR甲基化水平降低。持續(xù)的皮膚微生物感染能使更多的foxp3TSDR去甲基化，促進(jìn)foxp3的表達(dá)，導(dǎo)致外周血中nTreg升高進(jìn)而抑制正常的抗感染免疫反應(yīng)。
　　發(fā)現(xiàn)與前期其他在銀屑病，SLE，痤瘡，真菌感染或慢

11、性HSV感染中關(guān)于foxp3，foxp3 TSDR，和/或Tregs研究的結(jié)果是一致的。據(jù)所知，研究是第一次同時(shí)在自身免疫性疾病和慢性皮膚微生物感染中分析foxp3 TSDR甲基化水平。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論:外周血Foxp3基因TSDR甲基化狀態(tài)可以做為自身免疫病與感染性疾病的標(biāo)記物。Foxp3基因TSDR甲基化水平在不同的疾病以及疾病的不同的階段其表達(dá)水平不同，因此，通過(guò)檢測(cè)Foxp3基因TSDR甲基化水平，可以預(yù)測(cè)疾病的

12、進(jìn)展、預(yù)后以及判斷疾病的亞型。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳機(jī)制在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的重要性。另外，F(xiàn)oxp3基因TSDR甲基化水平還可用來(lái)監(jiān)測(cè)自身免疫性疾病療效觀察。
　　糾正Foxp3基因甲基化水平可以增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制作用以達(dá)到治療疾病的作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，活動(dòng)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Foxp3基因TSDR甲基化水平升高的程度較銀屑病等其它疾病更顯著，并經(jīng)治療后活動(dòng)期SLE轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔顒?dòng)期其Foxp3基因TSDR甲基化水平降低，調(diào)節(jié)性