大連地區(qū)胃癌甲基化敏感標(biāo)記物的判定.pdf

1、目的：胃癌（Gastric Cancer）是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其致死率在世界范圍內(nèi)位居所有惡性腫瘤的第二位，其中東亞、東歐及美洲中部和南部為胃癌高發(fā)區(qū)。胃癌在我國(guó)也是最常見(jiàn)、同時(shí)也是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。由于其發(fā)病隱匿，臨床癥狀在早期不明顯，病人一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多處于臨床晚期，目前對(duì)胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷缺少有效及敏感的方法，因而進(jìn)一步了解胃癌的發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)移特點(diǎn)對(duì)早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期預(yù)防胃癌都有重要的作用及意義。

2、 胃癌的發(fā)生是一個(gè)多基因、多因素、多階段及多途徑的復(fù)雜過(guò)程，涉及到遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)方面的改變，已有研究證實(shí)，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，表觀遺傳學(xué)改變起到了非常重要的作用。表觀遺傳學(xué)改變是一種未涉及DNA序列變化的基因外調(diào)控機(jī)制，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、基因印記、染色體重塑和非編碼RNA調(diào)控等。其中DNA甲基化是目前人們研究最為深入的一種表觀遺傳學(xué)修飾方式，DNA的甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下，以S腺

3、苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到CG二核苷酸序列中胞嘧啶碳原子上的一種化學(xué)反應(yīng)。CG二核苷酸富集的DNA片段稱為CpG島，哺乳動(dòng)物的CpG島長(zhǎng)約300-3000bp，CpG島常位于基因轉(zhuǎn)錄起始部位或起始部位附近，其中以脊椎動(dòng)物的管家基因?yàn)榇怼?大連地區(qū)具有自身特殊的地理地貌特點(diǎn)和這里的居民有長(zhǎng)期形成的飲食習(xí)慣。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大連居民大多喜食燒烤、腌制海鮮及泡菜等，而這類食物中含有大量的亞硝酸鹽類及多環(huán)芳烴類化

4、合物，其中許多是常見(jiàn)的致甲基化劑如亞硝酸鹽、笨并芘。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的刺激和積累，這些不佳的飲食習(xí)慣在很大程度上增加了本地區(qū)人群遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)變異的幾率和罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。 在前期工作中發(fā)現(xiàn)了大連地區(qū)胃癌COX-2、S100A4、p16、hMLH1、E-cadherin等基因和位點(diǎn)啟動(dòng)子區(qū)域存在異常的甲基化，導(dǎo)致相應(yīng)基因表達(dá)下調(diào)或缺失。其中部分結(jié)果與以往的研究結(jié)果相同，部分結(jié)果也有不同之處如COX-2基因的甲基化在大連地區(qū)胃癌中呈現(xiàn)

5、增高趨勢(shì)，這一現(xiàn)象提示大連地區(qū)胃癌的高發(fā)機(jī)制可能與其他地區(qū)胃癌的發(fā)生機(jī)制不同，大連地區(qū)胃癌表觀遺傳學(xué)改變可能與本地區(qū)特殊的環(huán)境因素及人群遺傳背景相關(guān)。 基于去甲基化劑能使因高甲基化而沉默的基因恢復(fù)表達(dá)的這一原理，使用去甲基化劑消除人類腫瘤細(xì)胞基因組DNA的異常甲基化成為人們近年研究的熱點(diǎn)。去甲基化劑如5-azacytidine、5-aza-2’-deoxycytidine和zebularine已被廣泛應(yīng)用于血液疾病臨床治療及多種

6、基礎(chǔ)研究中?；騿?dòng)子區(qū)的高甲基化與基因沉默之間有著非常重要的聯(lián)系，去甲基化劑同樣也被應(yīng)用于確認(rèn)腫瘤細(xì)胞中沉默的基因是否由表觀遺傳學(xué)修飾所引起的。隨著人們對(duì)腫瘤表觀遺傳學(xué)認(rèn)識(shí)的深入，去甲基化劑的研究和應(yīng)用有著光明的應(yīng)用前景，可能成為腫瘤治療的重要工具。 通過(guò)檢測(cè)特定區(qū)域腫瘤、癌前病變、癌旁相對(duì)正常及非癌正常對(duì)照胃粘膜組織的表觀遺傳學(xué)改變，判斷表觀遺傳學(xué)相關(guān)因素在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，探討大連地區(qū)胃癌高發(fā)的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的臨

7、床早期診斷、預(yù)防及治療提供新的理論依據(jù)和指導(dǎo)。 方法：全部標(biāo)本來(lái)自大連醫(yī)科大學(xué)遼寧?。ǜ咝＃┌┌Y基因組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的人胃癌組織庫(kù)。在冰凍組織微陣列技術(shù)和定點(diǎn)捕獲技術(shù)基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、免疫細(xì)胞化學(xué)法、RT-PCR、Westernblotting、細(xì)胞培養(yǎng)（加入去甲基化5-aza-dC）及甲基化特異性PCR（MSP）等方法，分別對(duì)不同病變胃組織及四個(gè)胃癌細(xì)胞系中10個(gè)敏感甲基化位點(diǎn)進(jìn)行了分析；并對(duì)6個(gè)基因的表達(dá)及其與該基

8、因啟動(dòng)子甲基化之間關(guān)系進(jìn)行了探討；在以往的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上還對(duì)本地區(qū)胃癌CIMP鑒定體系進(jìn)行初步的摸索和創(chuàng)新。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12．0軟件，應(yīng)用Kruskal-Wallis和Mamm Whitney檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 一、10個(gè)敏感位點(diǎn)在不同病變胃黏膜組織中的甲基化狀態(tài) 甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果顯示：在胃鏡、癌旁相對(duì)正常、癌前病變及胃癌組中，10個(gè)位點(diǎn)的甲基化頻率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，除MINT2和T

9、HBS1基因外其余8個(gè)基因在正常胃組織中均有不同程度的甲基化，其中hMLH1、TIMP3、RASSF1A、MINT1、MINT2和E-cadherin基因在胃鏡組和胃病變組（癌旁相對(duì)正常、癌前病變、胃癌）間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； hMLH1、TIMP3、RASSF1A、MINT2和E-cadherin基因在胃鏡組和癌旁相對(duì)正常組間存在顯著差別； p16、hMLH1、TIMP3、RASSF1A和MINT2基因在胃癌的發(fā)生過(guò)程中表現(xiàn)出持續(xù)的高

10、甲基化水平。 一、10個(gè)敏感位點(diǎn)在四個(gè)胃癌細(xì)胞系中的甲基化狀態(tài) 甲基化特異性PCR結(jié)果顯示：10個(gè)位點(diǎn)在四個(gè)胃癌細(xì)胞系（MGC803、BGC823、AGS和HGC-27）中的甲基化狀態(tài)為：AGS細(xì)胞系有兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化（p16和TIMP3）；MGC803細(xì)胞系有三個(gè)位點(diǎn)的甲基化（TIMP3、RASSF1A和MINT1）；BGC823細(xì)胞系有四個(gè)位點(diǎn)的甲基化（TIMP3、RASSF1A、MINT1和MINT2）；HGC-2

11、7細(xì)胞系有5個(gè)位點(diǎn)的甲基化（p16、TIMP3、RASSF1A、MINT2和E-cad）。 三、甲基化高發(fā)位點(diǎn)在胃粘膜組織及四個(gè)胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 免疫組織/細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：p16、hMLH1、TIMP3、DKK3和E-cadherin五個(gè)基因在不同進(jìn)展期胃病變中的表達(dá)與其甲基化結(jié)果基本呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)了基因啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化使相應(yīng)基因表達(dá)下調(diào)或沉默。組織標(biāo)本（G-102，腸上皮化生）和胃癌細(xì)胞系（MGC803、B

12、GC823和HGC-27）中有TIMP3基因甲基化和表達(dá)同時(shí)存在的情況，可能涉及到該基因部分甲基化或者部分細(xì)胞未甲基化及自動(dòng)去甲基化等原因。 四、CIMP體系的建立 參照以往研究的結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)室之前對(duì)大連地區(qū)胃癌CIMP體系的初步探討加上本實(shí)驗(yàn)對(duì)大連地區(qū)胃癌多基因甲基化與表達(dá)的研究，嘗試采用p16、hMLH1、TIMP3、RASSF1A和MINT2五個(gè)指標(biāo)建立一個(gè)更適合本地區(qū)胃癌早期診斷和發(fā)現(xiàn)的CIMP鑒定體系。結(jié)果證實(shí)

13、此體系在胃癌發(fā)生的早期就表現(xiàn)出很高的靈敏性，有利于對(duì)易患個(gè)體進(jìn)行胃癌的早期預(yù)警、早期預(yù)防和早期診斷。 五、去甲基化劑5-aza-dC在胃癌細(xì)胞系中的應(yīng)用 用去甲基化劑處理MGC803和HGC-27細(xì)胞系，結(jié)果顯示使用去甲基化后，MGC803細(xì)胞系中RASSF1A基因在mRNA和蛋白水平恢復(fù)了表達(dá)，TIMP3基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)有所增強(qiáng)；HGC-27細(xì)胞系p16、RASSF1A、和E-cadherin基因恢復(fù)了m

14、RNA和蛋白水平的表達(dá)，TIMP3基因mRNA和蛋白的表達(dá)也有所增強(qiáng)。這些結(jié)果證實(shí)了DNA甲基化是抑癌基因或修復(fù)基因等的主要失活因素，因而在胃癌的發(fā)生發(fā)展中表觀遺傳學(xué)修飾起到了重要的作用。 結(jié)論： 一、表觀遺傳學(xué)改變尤其是DNA的甲基化是胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要事件。大連地區(qū)胃癌呈現(xiàn)出多位點(diǎn)高甲基化特點(diǎn)，并且隨著病變的進(jìn)展，基因的甲基化程度增強(qiáng)，甲基化位點(diǎn)也增加。與其他地區(qū)胃癌的研究結(jié)果相比，本地區(qū)人群在正常胃組織中有多

15、個(gè)基因（p16、hMLH1、TIMP3和RASSF1A等）的甲基化程度較高，這表明大連地區(qū)存在甲基化易患性，這些可能與本地區(qū)的飲食、環(huán)境等因素相關(guān)。 二、CIMP體系用于評(píng)估腫瘤基因組整體甲基化狀態(tài)，個(gè)體CIMP型的鑒定對(duì)臨床腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)、預(yù)防及預(yù)后評(píng)價(jià)有重要作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，不同基因在不同地區(qū)胃癌中的甲基化狀態(tài)不同，因而對(duì)某個(gè)地區(qū)胃癌整體甲基化進(jìn)行評(píng)估時(shí)應(yīng)多采用一些甲基化敏感基因，從中選出適合本地區(qū)胃癌特點(diǎn)的檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)而

16、建立自身的CIMP鑒定體系?；谶@樣的理念，選用p16、hMLH1、TIMP3、RASSF1A和MINT2五個(gè)指標(biāo)建立了一個(gè)適合大連地區(qū)胃癌早期發(fā)現(xiàn)和診斷的CIMP體系。這五個(gè)指標(biāo)在以往的研究中均被證實(shí)與胃癌關(guān)系密切，但將這五個(gè)位點(diǎn)作為綜合參考指標(biāo)評(píng)估本地區(qū)胃癌CIMP體系尚屬首次。 三、腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)出基因組整體的低甲基化和局部區(qū)域（抑癌基因、修復(fù)基因等）的異常高甲基化，啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化可抑制相應(yīng)基因的失活，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)

17、生。對(duì)p16、hMLH1、TIMP3、DKK3和E-cadherin五個(gè)基因在胃癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)情況的研究證明，基因的表達(dá)與其甲基化狀態(tài)基本呈負(fù)相關(guān)，基因的甲基化狀態(tài)調(diào)控并影響著相應(yīng)基因的表達(dá)、表達(dá)下調(diào)和失活。 四、TIMP3基因在胃癌組織及細(xì)胞系中可能存在部分甲基化。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR法對(duì)胃病變組織和胃癌細(xì)胞系的檢測(cè)結(jié)果表明TIMP3基因能夠同時(shí)存在基因的甲基化和表達(dá)，這一結(jié)果對(duì)DNA的甲基化有了新的認(rèn)識(shí)。而T

18、IMP3基因甲基化與否和甲基化的程度可能與胃癌患者的預(yù)后有關(guān)。 五、在胃癌的發(fā)生過(guò)程中，表觀遺傳學(xué)改變較遺傳學(xué)改變相比，起到了更為重要的作用，因而未來(lái)對(duì)胃癌的治療重點(diǎn)也要放到表觀遺傳學(xué)方面。用去甲基化劑5-aza-dC處理MGC803和HGC-27兩個(gè)細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)許多抑癌基因的失活是由于基因甲基化引起的，因而推測(cè)不論在胃癌組織還是在胃癌細(xì)胞中，抑癌基因表達(dá)下調(diào)或沉默是相應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的結(jié)果。這一發(fā)現(xiàn)也為日后胃癌的有效