胃癌細(xì)胞系中死亡受體甲基化的研究.pdf

1、胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，其死亡率居當(dāng)今世界癌癥致死率的第二位。在中國，胃癌的致死率更是位列各種癌癥之首。與其它惡性腫瘤相似，胃癌也是多基因遺傳以及表觀遺傳的改變共同作用的結(jié)果。胃癌很多是從慢性胃粘膜病變演變而來，而其演變的機(jī)制依然不明。
　　人類基因組中具有兩種遺傳學(xué)信息:即傳統(tǒng)意義上的遺傳學(xué)信息提供了功能性蛋白質(zhì)合成所需要的模板;而表遺傳學(xué)的信息則提供了這些遺傳學(xué)信息指令所執(zhí)行的特定時(shí)間，地點(diǎn)以及方式。對(duì)惡性腫瘤的多年研究

2、使人們認(rèn)識(shí)到幾乎所有人類腫瘤不僅僅是由基因結(jié)果改變引起的，而表觀遺傳學(xué)的異常同樣起著舉足輕重的作用。表觀遺傳學(xué)改變主要包括DNA甲基化改變和組蛋白修飾，這兩種調(diào)控模式本身及之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)可導(dǎo)致印記丟失，染色質(zhì)重塑，非必需重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄、基因的異?；罨约耙职┗虻漠惓３聊?。表觀遺傳學(xué)的研究為進(jìn)一步了解腫瘤的各種特性，優(yōu)化腫瘤的早期診斷，改善腫瘤的預(yù)后提供了嶄新的策略。
　　DNA甲基化所致基因表觀遺傳學(xué)轉(zhuǎn)錄失活已經(jīng)成為腫瘤表

3、觀基因組學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容。基因組水平上研究DNA甲基化模式不僅對(duì)于腫瘤疾病的診斷、治療和預(yù)后判斷具有重要的實(shí)用價(jià)值，而且腫瘤細(xì)胞CpG島甲基化所致相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)轉(zhuǎn)錄沉默也為Knudson“二次打擊(two-hit)”經(jīng)典假說做出了重要的補(bǔ)充。
　　死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)基因超家族，其胞外區(qū)有一段富含半胱氨酸的區(qū)域，而胞質(zhì)區(qū)具有同源氨基酸殘基構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域，后者具有蛋白水解功能，稱作死亡結(jié)構(gòu)域(death do

4、main，DD)。通過死亡結(jié)構(gòu)域，死亡信號(hào)得以進(jìn)一步傳遞，最終啟動(dòng)凋亡的發(fā)生。目前已知的死亡受體有5種，分別是TNFR1（又稱CD120a或p55），CD95（又稱FAS/Apo-1），DR3（又稱Wsl—1/Ap03/ TRAMP)，DR4，DR5。前三種受體的配體分別是TNF，CD95L(FasL)，Apo-3L，而DR4和DR5的配體均為TRAIL(APO-2L)。與前三種受體啟動(dòng)的凋亡通路不同，DR4和DR5具有其自身的鮮明特點(diǎn)

5、。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，TRAIL與死亡受體結(jié)合可選擇性的誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)大多數(shù)正常細(xì)胞無明顯的殺傷作用121。這一特性使其優(yōu)于TNF配體家族的其它成員，成為腫瘤治療的新動(dòng)力。
　　目前，有多項(xiàng)研究表明DR4和DR5在多種腫瘤細(xì)胞中存在低表達(dá)的現(xiàn)象，而且其表達(dá)水平的下降可能與其基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化相關(guān)。但是，目前在胃癌細(xì)胞中尚沒有對(duì)DR4和DR5甲基化的詳盡研究。因此，本研究以多種人胃癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，重點(diǎn)研究DR4和DR5

6、在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平以及甲基化狀態(tài)，并通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)來研究去甲基化藥物5-Aza-CdR對(duì)其甲基化的影響，從而為胃癌發(fā)生機(jī)制的研究以及胃癌的治療探索新的思路。
　　方法:
　　1、常規(guī)培養(yǎng)4株胃癌細(xì)胞株，分別AGS，SGC7901，MKN28，MGC803。
　　2、取兩例胃大部切除術(shù)后的胃正常上皮組織作為對(duì)照。
　　3、RT-PCR方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞株內(nèi)DR4和DR5的RNA表達(dá)水平。
　　4、West

7、ern blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞株內(nèi)DR4和DR5的蛋白表達(dá)水平。
　　5、 MS-PCR檢測(cè)胃癌細(xì)胞株內(nèi)DR4和DR5啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。
　　6、RT-PCR方法檢測(cè)5-Aza-CdR處理后的胃癌細(xì)胞株內(nèi)DR4和DR5的RNA表達(dá)水平。
　　7、Western blot方法檢測(cè)5-Aza-CdR處理后的胃癌細(xì)胞株內(nèi)DR4和DR5的RNA表達(dá)水平。
　　8、 MS-PCR檢測(cè)5-Aza-CdR處理后的胃癌細(xì)胞株內(nèi)D

8、R4和DR5啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。
　　9、建立胃癌裸鼠移植瘤模型。
　　10、測(cè)定5-Aza-CdR處理后的胃癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線。
　　11、RT-PCR方法檢測(cè)5-Aza-CdR處理后的胃癌裸鼠移植瘤內(nèi)DR4和DR5的 RNA表達(dá)水平。
　　12、Western blot方法檢測(cè)5-Aza-CdR處理后的胃癌裸鼠移植瘤內(nèi)DR4和DR5的RNA表達(dá)水平。
　　13、MS-PCR檢測(cè)5-Aza-CdR處理后

9、的胃癌裸鼠抑制瘤內(nèi)DR4和DR5啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。
　　14、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1、胃癌細(xì)胞中DR4和DR5在mRNA水平存在表達(dá)水平下調(diào)。在MKN28，MGC803，AGS以及SGC7901細(xì)胞系中，DR4的mRNA表達(dá)水平經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析均低于對(duì)照組(P＜0.05); DR5的mRNA表達(dá)水平與DR4相似，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，除MGC803外，其它胃癌細(xì)胞均低于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　2、胃癌

10、細(xì)胞中DR4和DR5在蛋白水平存在表達(dá)水平下調(diào)。在MKN28，MGC803，AGS以及SGC7901細(xì)胞系中，DR4的蛋白表達(dá)水平經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，均明顯低于對(duì)照組;DR5的蛋白表達(dá)水平與DR4相似，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，除了MGC803外，其它胃癌細(xì)胞均低于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　3、胃癌細(xì)胞中DR4和DR5的啟動(dòng)子區(qū)存在異常甲基化。在MKN28，MGC803，AGS以及SGC7901細(xì)胞系中，DR4均為部分甲基化，而DR5除MGC803

11、為非甲基化外，其余細(xì)胞系中均為部分甲基化。
　　4、5-Aza-CdR能夠逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞中DR4和DR5的啟動(dòng)子甲基化水平，并上調(diào)DR4和DR5的表達(dá)水平。檢測(cè)不同濃度5-Aza-CdR處理胃癌細(xì)胞系MKN28，AGS及SGC7901不同時(shí)間后的細(xì)胞增殖狀態(tài)，結(jié)果顯示5-Aza-CdR可明顯抑制細(xì)胞增殖(P＜0.05)，且明顯表現(xiàn)出藥物濃度及作用時(shí)間依賴性;檢測(cè)胃癌細(xì)胞系在5-Aza-CdR作用后的凋亡狀態(tài)，5-Aza-CdR明顯誘

12、導(dǎo)了細(xì)胞凋亡;檢測(cè)胃癌細(xì)胞系中DR4和DR5的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示5-Aza-CdR能上調(diào)胃癌細(xì)胞系中DR4和DR5的表達(dá)水平，并且具有藥物濃度及作用時(shí)間依賴性。
　　5、5-Aza-CdR能夠抑制胃癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，并且具有作用時(shí)間依賴性。胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線表明:5-Aza-CdR(1g/Kg)能抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，且隨時(shí)間增加抑制效果明顯。
　　6、5-Aza-CdR能夠逆轉(zhuǎn)胃癌裸鼠移植瘤中DR4和DR

13、5的啟動(dòng)子甲基化水平，并上調(diào)DR4和DR5的表達(dá)水平。通過檢測(cè)5-Aza-CdR（1g/Kg）對(duì)胃癌裸鼠移植瘤中DR4和DR5表達(dá)水平影響，結(jié)果顯示5-Aza-CdR能促進(jìn)DR4和DR5的表達(dá)水平;檢測(cè)5-氮雜胞苷(1g/Kg)對(duì)胃癌裸鼠移植瘤中DR4和DR5啟動(dòng)子甲基化水平影響，結(jié)果顯示5-氮雜胞苷(1g/Kg)能顯著抑制DR4和DR5啟動(dòng)子甲基化水平。
　　結(jié)論:
　　1、在胃癌細(xì)胞中DR4和DR5無論在mRNA水平還是