慢性應(yīng)激抑郁型小鼠黃褐斑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究.pdf

1、黃褐斑的病因復(fù)雜，主要致病因素有紫外線照射、內(nèi)分泌失調(diào)、情緒變化等。長(zhǎng)期紫外線照射可使黑色素細(xì)胞增殖，而黑素的生成是酪氨酸酶一系列氧化反應(yīng)并使體內(nèi)氧化與抗氧化過(guò)程出現(xiàn)異常，如過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO)升高、SOD下降等，所以可以通過(guò)皮膚黑色素病理形態(tài)學(xué)，LPO的衍生物MDA及SOD量的變化研究黃褐斑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。本課題采用慢性應(yīng)激刺激法致小鼠出現(xiàn)抑郁癥狀，用雌激素(黃體酮)全身攻擊小鼠，并同時(shí)對(duì)其進(jìn)行局部照射紫外線來(lái)建立黃褐斑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行

2、探討，并與其他小鼠黃褐斑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行對(duì)照研究。 目的： 通過(guò)給小鼠進(jìn)行紫外線照射局部、注射黃體酮和慢性應(yīng)激抑郁刺激法綜合作用，建立慢性應(yīng)激抑郁型小鼠黃褐斑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并與紫外線照射動(dòng)物模型建立的方法對(duì)比觀察。 材料與方法： 一、材料 1、動(dòng)物 健康雌性BALB/C小鼠，清潔級(jí)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。 2、實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 黃體酮注射液20mg/ml，超氧化物

3、歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，HMB45鼠單克隆抗體(英國(guó)abcam公司)。 3、實(shí)驗(yàn)器材 德國(guó)DuaLight TM UVA/UVB高能紫外光治療儀(UV120-2)；CMIAS多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)2000型(空軍總醫(yī)院與北京航空航天大學(xué)共同研制的)。 二、方法 (一)動(dòng)物分組 取小鼠30只，隨機(jī)分為3組：正常組6只、紫外線組12只、慢性應(yīng)激抑

4、郁組12只。造模時(shí)間，第一批小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)行21天，第二批小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)行28天。 (二)實(shí)驗(yàn)分組 1、正常組：每周脫毛1～2次，每天肌肉注射注射用水5ml/kg體質(zhì)量，連續(xù)21天觀察小鼠的脫毛部位皮膚變化情況。 2、紫外線組：先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到BALB/c小鼠皮膚長(zhǎng)波紫外線(UVA330nm～380nm)最小光毒量(MPD)為10J/cm2，中波紫外線(UVB304nm～311nm)最小紅斑量( MED)為660mJ/c

5、m2。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出照射方法，第1天以0.7MPD+0.7MED每日照射一次，連續(xù)照射6天，第7天小鼠皮膚出現(xiàn)輕微結(jié)痂脫屑，停止照射2天；第9天、第12天以0.5MPD+0.5MED照射一次，第16天、第19天以0.25MPD+0.25MED照射一次；第一批照射21天。第二批在停止刺激后一周處死。 3、慢性應(yīng)激抑郁組：按照經(jīng)典抑郁模型加以改進(jìn)處理方法：紫外線照射方法同紫外線組。每日肌肉注射0.4％黃體酮5ml/kg體質(zhì)量，第一批

6、小鼠連續(xù)21天。第二批小鼠在停止全部刺激后一周處死。 (三)抑郁模型測(cè)定 1、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 2、實(shí)驗(yàn)開(kāi)始結(jié)束時(shí)小鼠體質(zhì)量(體重)變化 3、液體消耗試驗(yàn) (四)MDA及SOD活性測(cè)定 同時(shí)取肝臟及脫毛部位皮膚，用預(yù)冷生理鹽水(4℃)沖洗，除盡雜質(zhì)，拭干，切取皮膚0.2g、肝臟0.5g，分別放入有9倍于組織塊的預(yù)冷生理鹽水的小試管內(nèi)，將剪碎的組織倒入玻璃均漿管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨20～30次，充分研碎

7、，使組織均漿化。均漿后以3500r/min離心8分鐘，取上清液采用試劑盒檢測(cè)MDA、SOD活性。 (五)皮膚黑色素細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)觀察 第一批小鼠當(dāng)脫毛部位皮膚出現(xiàn)明顯的色變(照射21天)，取去毛皮膚1塊(1cm×1cm)，10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片。再經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)后，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法，用HMB45為第一抗體，免疫組化二步法，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。第二批小鼠在實(shí)驗(yàn)28天后

8、處死取皮，余病理步驟同上。 (六)黑色素陽(yáng)性目標(biāo)用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象分析 每張切片在顯微鏡物鏡40X下，隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行彩色圖像采集與存儲(chǔ)，計(jì)算出每個(gè)視野的形態(tài)學(xué)陽(yáng)性目標(biāo)(靶目標(biāo))中的數(shù)密度、光密度參數(shù)的總和平均數(shù)，各組間參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)、標(biāo)準(zhǔn)誤、變異系數(shù)。 (七)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以(-x±S)表示，進(jìn)行方差分析，t檢驗(yàn)。 結(jié)果： 一、抑郁模型

9、 黃體酮+紫外線+慢性應(yīng)激抑郁組小鼠的穿格次數(shù)、直立次數(shù)、理毛次數(shù)均較正常組有所減少，并有顯著差異。體重增加最少，糖水消耗顯著低于正常組(P<0.05)提示慢性應(yīng)激刺激21天后的小鼠出現(xiàn)了抑郁的征象。 二、MDA及SOD的水平 在5組中，紫外線組、慢性應(yīng)激抑郁組兩種模型小鼠肝臟與皮膚的MDA水平均較正常組升高，SOD活性較正常組有所下降。其中，慢性應(yīng)激抑郁組21天組小鼠皮膚SOD經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有極顯著性差異(p<0.01)

10、，慢性應(yīng)激抑郁組28天組小鼠皮膚、肝臟MDA有極顯著性差異(p<0.01)。提示這種模型建立法對(duì)于小鼠皮膚、肝臟MDA、SOD的活性影響非常大。 三、皮膚黑色素細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 (一)小鼠表皮黑色素沉著數(shù)量 模型組小鼠皮膚黑素細(xì)胞的個(gè)數(shù)均較正常組有所增加，其中慢性應(yīng)激抑郁21天組有顯著性差異。模型組數(shù)密度明顯高于正常組，尤其是慢性應(yīng)激抑郁模型21天組可見(jiàn)與正常組有顯著差異。 (二)小鼠表皮黑色素沉著深

11、淺度 模型組小鼠皮膚黑色素陽(yáng)性目標(biāo)的平均光密度明顯高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示慢性應(yīng)激抑郁型小鼠黃褐斑模型組黑色素著色面積、黑色素細(xì)胞數(shù)量明顯大于正常組，黑色素著色深度明顯增加，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后有顯著性差異。小鼠皮膚和肝臟的MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低，符合黃褐斑的生物化學(xué)改變特征，具備黃褐斑的主要臨床特征。 本實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)在于方便計(jì)算紫外線照射量，照射部位及取材部位固定，