β-catenin、nm23H-,1-、Tiam-1與胃癌生物學(xué)行為關(guān)系的研究.pdf

1、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、多階段的過(guò)程，其中涉及多種癌基因、抑癌基因、錯(cuò)配修復(fù)基因、細(xì)胞黏附因子等的異常改變，而轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程，多種基因結(jié)構(gòu)和功能的異常在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移與其運(yùn)動(dòng)能力密不可分，細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的同時(shí)，還可以整合內(nèi)、外源信號(hào)，參與細(xì)胞分泌、接觸抑制、增殖和凋亡等多種生物活動(dòng)。β-catenin是細(xì)胞中的一種多功能蛋白質(zhì)，很多腫

2、瘤的預(yù)后與β-catenin有相關(guān)性。Tiam-1是一個(gè)細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子，而β-catenin具有細(xì)胞黏附和信號(hào)傳導(dǎo)功能。nm23是近年來(lái)研究較多的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，但是，不同的研究發(fā)現(xiàn)，在不同類型的腫瘤細(xì)胞中，nm23的作用不同。即使同樣是胃癌，其作用也不盡相同。本研究主要探討三者在胃癌發(fā)展中的相互關(guān)系。 材料與方法： 1.病例選擇：收集2003-2005年中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科術(shù)后大體標(biāo)本，共63例，所有患者

3、術(shù)前均未進(jìn)行化療或者放療，年齡范圍26-78歲，平均年齡56歲，其中高分化腺癌30例，低分化腺癌30例，未分化癌3例。同時(shí)收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)鏡科活檢標(biāo)本，慢性淺表性胃炎30例，年齡范圍25-68歲，平均年齡46歲。 2.取材：標(biāo)本一部分于10％福爾馬林中固定，石蠟包埋，另外留取新鮮標(biāo)本，剪成小塊立即放入液氮，并轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。 3.β-catenin鼠抗人單克隆抗體及nm23H1單克隆抗體工作液、PV9

4、000試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新試劑公司。經(jīng)GeneBank檢索，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)β-catenin、nm23H1及Tiam-1的引物。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。RT-PCR所用Taq酶、dNTP、Marker等均購(gòu)自大連寶生物公司。 4.方法：采用二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。nm23H1主要位于癌細(xì)胞漿內(nèi)，少數(shù)位于細(xì)胞膜上，為棕色顆?；驁F(tuán)塊，β-catenin主

5、要位于細(xì)胞核內(nèi)，少數(shù)位于細(xì)胞漿中，為棕黃色顆粒或團(tuán)塊，著色細(xì)胞數(shù)大于10％為陽(yáng)性，全片未見(jiàn)著色或著色細(xì)胞數(shù)小于10％為陰性?？俁NA提取嚴(yán)格按照TRIZOL試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，RNA純度：OD260/OD280≈1.65-1.96。 逆轉(zhuǎn)錄cDNA：RNA3μl，反應(yīng)體系：2×buffer15μl、MgSO4(25mM)6μl、AMV(22u/μl)1.5μl、dNTPs(10mM)1.5μl、o

6、ligodT(50μM)1.5μl、RNase-inhibitor(40u/μl)0.75μl、ddH2O0.75μl，按以下條件進(jìn)行：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：65℃1分鐘PCR反應(yīng)體系：cDNA3μl，2×buffer2.5μl、MgSO4(25mM)6μl、dNTPs(2.5mM)2μl、Taq-E(5u/μl)0.2μl、ddH2O17.1μl、β-catenin、nm23H1及Tiam-1引物各0.1μl(濃度5pmol/μl)。擴(kuò)增按以下

7、條件進(jìn)行反應(yīng)：94℃預(yù)變性3分鐘，94℃變性40秒鐘，57℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延長(zhǎng)7分鐘。β-actin作為內(nèi)對(duì)照?；驍U(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，拍照。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：檢驗(yàn)采用x2檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 討論：β-catenin是一種多功能蛋白質(zhì)，具有細(xì)胞黏附和信號(hào)傳導(dǎo)功能，細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)的β-catenin與E-cadherin相結(jié)合，通過(guò)α-caten

8、in與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相連，參與細(xì)胞間的黏附和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。當(dāng)E-cadherin-catenin復(fù)合物中的任一結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，都會(huì)影響細(xì)胞間連接。細(xì)胞內(nèi)單聚體的β-catenin增多，與Tcf或者Lef結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞核，而Tcf/Lef是DNA結(jié)合蛋白，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)后，作為轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)的DNA結(jié)合，促進(jìn)靶基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。當(dāng)該蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜表達(dá)減弱或缺失，導(dǎo)致α-catenin不能與cadherin相連接，影響細(xì)胞間的正常連接，從而使腫瘤

9、細(xì)胞的黏附能力下降，獲得轉(zhuǎn)移、侵襲的能力。nm23基因編碼的產(chǎn)物為核苷二磷酸激酶，是一類廣泛存在的酶，至少參與兩個(gè)在腫瘤和發(fā)育上起重要作用的功能，即微管的聚合/解聚和G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。在信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程中使GDP還原為GTP，激活G蛋白，參與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。Tiam-1基因能夠調(diào)節(jié)E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞黏附，并與Rho一起參與黏附復(fù)合物的組裝。本研究中，在胃癌組織中β-catenin在胃癌細(xì)胞膜的表達(dá)缺失，細(xì)胞核中的陽(yáng)性表達(dá)

10、率明顯高于淺表性胃炎，且低分化組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)明顯高于高分化組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。β-cateninmRNA在胃癌及淺表性胃炎中均有表達(dá)，而二者之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在胃癌低分化組及高分化組以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組及陰性組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低分化組nm23H1表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于高分化者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組nm23H1表達(dá)的陽(yáng)性率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，nm23H1基因表達(dá)與胃癌細(xì)胞分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。nm23

11、H1對(duì)β-catenin的表達(dá)可能存在一定的抑制作用。但是nm23H1對(duì)于Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的這種抑制作用可能表現(xiàn)在β-catenin蛋白進(jìn)入細(xì)胞核之前或者進(jìn)入細(xì)胞核之后，而不是作用在mRNA上。胃癌組織中Tiam-1的mRNA陽(yáng)性率明顯高于淺表性胃炎，而且低分化組及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組高于高分化組及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組，提示在胃癌的惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移過(guò)程中，Tiam-1起促進(jìn)而非抑制作用。雖然Tiam-1能夠與E-cadherin在膜連接處形成功

12、能上的耦連，但是β-catenin的異常表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞間的cadherin-catenin正常連接出現(xiàn)異常，而Tiam-1的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移以及參與基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞增殖的作用尤顯突出，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及侵襲、轉(zhuǎn)移。 結(jié)論： 1.β-catenin蛋白的表達(dá)與胃癌的分化程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)。nm23H1蛋白的表達(dá)與胃癌的分化程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)。 2.β-cateninmRNA的表達(dá)與胃癌的分化程度及轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。nm23H