羥基紅花黃色素A促進激素誘導兔骨髓基質細胞成骨分化及其MAPK信號轉導機制的研究.pdf

1、目的：
　　探討羥基紅花黃色素A(HSYA)促進激素誘導的股骨頭缺血壞死模兔股骨頭髓內及離體兔骨髓基質細胞(BMSCs)成骨分化及其MAPK信號轉導通路的作用機制。
　　方法：
　　1.健康成年新西蘭大白兔48只，抽簽法隨機分為空白組、模型組，模型組采用臀肌注射醋酸潑尼松龍(7.5mg/kg)結合強迫立位制備激素性股骨頭缺血壞死模型。造模成功后抽簽法將模型組兔隨機分為模型對照組、髓芯減壓組、生理鹽水+髓芯減壓組、HSY

2、A+髓芯減壓組，髓芯減壓組僅行髓芯減壓術，生理鹽水+髓芯減壓組采用髓芯減壓術配合髓腔內注射生理鹽水，HSYA+髓芯減壓組采用髓芯減壓術配合髓腔內注射HSYA，空白組和模型對照組不作治療。1周后兔麻醉，腹主動脈采血，采用化學比色法、氧化酶法檢測各組兔血清中堿性磷酸酶、甘油三脂的含量;取出股骨頭，光學顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察各組兔股骨頭的形態(tài)結構;RT-PCR檢測各組兔股骨頭中Cbfα1及Collagen-ⅠmRNA的表達;Western

3、Blotting檢測各組兔股骨頭中p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白的表達。
　　2.健康成年新西蘭大白兔36只，無菌條件下于脛骨上端內側骨髓腔穿刺抽取骨髓血，分離、體外培養(yǎng)BMSCs，流式細胞儀檢測細胞表面標記物結合成骨、成脂誘導劑誘導對其鑒定。取第3代生長良好的BMSCs，抽簽法隨機分為空白組，模型組及HSYA低、中、高劑量組。模型組用大劑量地塞米松誘導BMSCs成脂分化，HSYA低、中、高劑量組加入地塞米松的同時分別加入

4、不同濃度的HSYA;空白組無特殊處理。6d后，透射電子顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)結構，檢測細胞內堿性磷酸酶、甘油三脂的含量，RT-PCR檢測細胞中Cbfα1及Collagen-ⅠmRNA的表達，WesternBlotting檢測細胞中p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白的表達。
　　結果：
　　1.HSYA促進激素誘導兔BMSCs成骨分化及其MAPK信號轉導機制的在體實驗:
　　(1)血清中成骨標志物堿性磷酸酶、成脂標

5、志物甘油三脂含量的檢測:干預1周后，空白組、髓芯減壓組、生理鹽水+髓芯減壓組和HSYA+髓芯減壓組兔血清中堿性磷酸酶含量明顯高于模型對照組，甘油三脂含量明顯低于模型對照組（P＜0.05）。其中HSYA+髓芯減壓組堿性磷酸酶含量明顯高于髓芯減壓組和生理鹽水+髓芯減壓組（P＜0.05），甘油三脂含量明顯低于髓芯減壓組和生理鹽水+髓芯減壓組（P＜0.05）。
　　(2)光鏡觀察股骨頭組織的病理改變:空白組軟骨下骨小梁致密，排列規(guī)則整齊;

6、骨細胞清晰，核位于中央，較大;髓腔內可見增生活躍的骨髓組織，造血細胞豐富。模型對照組軟骨層變薄、結構紊亂，骨小梁較稀疏，部分有斷裂現(xiàn)象，小梁中有骨細胞壞死;軟骨下區(qū)骨髓內脂肪細胞增多，造血細胞數(shù)量減少。髓芯減壓組、生理鹽水+髓芯減壓組、HSYA+髓芯減壓組骨細胞結構較清晰，骨小梁較多，壞死骨細胞較模型對照組少，其中尤以HSYA+髓芯減壓組最為明顯。
　　(3)透射電鏡觀察股骨頭組織的超微結構:空白組軟骨細胞粗面內質網豐富，無明顯脫

7、顆粒;線粒體較多，嵴結構清晰，未見明顯斷裂;染色質分布相對均勻，細胞表面突起較多。模型對照組空泡樣變較空白組明顯增多，異染色質部分邊聚，胞內可見較大脂滴或次級溶酶體。HSYA+髓芯減壓組空泡樣變明顯減少，次級溶酶體明顯減少，大部分線粒體嵴存在。
　　(4)股骨頭中成骨標志物Cbfα1及Collagen-ⅠmRNA的表達:干預1周后，空白組、髓芯減壓組、生理鹽水+髓芯減壓組和HSYA+髓芯減壓組明顯高于模型對照組（P＜0.05）。其

8、中HSYA+髓芯減壓組明顯高于髓芯減壓組和生理鹽水+髓芯減壓組（P＜0.05）。
　　(5)股骨頭中與MAPK信號通路相關的p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白的表達:干預1周后，空白組、髓芯減壓組、生理鹽水+髓芯減壓組和HSYA+髓芯減壓組p-ERK1、p-ERK2蛋白表達明顯高于模型對照組（P＜0.05），p-JNK、p-P38蛋白表達明顯低于模型對照組（P＜0.05）。其中HSYA+髓芯減壓組p-ERK1、p-ERK2蛋白

9、表達明顯高于髓芯減壓組和生理鹽水+髓芯減壓組（P＜0.05），p-JNK、p-P38蛋白表達明顯低于髓芯減壓組和生理鹽水+髓芯減壓組（P＜0.05）。
　　2.HSYA促進激素誘導兔BMSCs成骨分化及其MAPK信號轉導機制的離體實驗:
　　(1)油紅“O”染色結果:空白組未發(fā)現(xiàn)紅染的脂肪顆粒;模型組發(fā)現(xiàn)細胞的胞漿內可見大量染成紅色的脂肪滴，呈誘導后的脂肪細胞形態(tài);HSYA低、中、高劑量組發(fā)現(xiàn)有脂肪滴分布，三組紅染脂肪滴明顯

10、少于模型組，HSYA高劑量組脂肪滴明顯少于模型組，少于中、低劑量組。
　　(2)透射電鏡觀察BMSCs的超微結構:各組細胞干預6d后，空白組細胞呈橢圓形或不規(guī)則狀，細胞質少，核大，未見明顯脫顆?，F(xiàn)象。模型組細胞呈長梭形，未見明顯核仁;細胞器中線粒體較多呈空泡，可見較多次級溶酶體或脂滴。HSYA低劑量組表面空泡不太明顯，損傷的線粒體數(shù)量較模型組少，脂滴減少。HSYA中劑量組線粒體較低劑量組增多，空泡樣變化減少，次級溶酶體減少，未見明

11、顯脂滴。HSYA高劑量組線粒體明顯增多，空泡樣變明顯減少，次級溶酶體明顯減少，未見明顯脂滴。
　　(3)BMSCs中成骨標志物堿性磷酸酶、成脂標志物甘油三脂含量的檢測:各組細胞干預6d后，模型組BMSCs內堿性磷酸酶含量較空白組明顯下降（P＜0.05），而HSYA各組較模型組均有明顯升高（P＜0.05），且隨著劑量的加大，堿性磷酸酶含量呈上升趨勢。模型組BMSCs內甘油三脂含量較空白組明顯升高（P＜0.05），而HSYA各組較模型

12、組均有明顯降低（P＜0.05），且隨著HSYA劑量的加大，甘油三脂含量呈下降趨勢。
　　(4)BMSCs中成骨標志物Cbfα1及Collagen-ⅠmRNA的表達:各組細胞干預6d后，模型組細胞內Cbfα1、Collagen-ⅠmRNA含量均明顯低于空白組（P＜0.05），而HSYA各組Cbfα1、Collagen-ⅠmRNA含量均明顯高于模型組（P＜0.05），且隨著HSYA劑量的增加，細胞內Cbfα1、Collagen-ⅠmR

13、NA含量呈上升趨勢。
　　(5)BMSCs中與MAPK信號通路相關的p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白的表達:各組細胞干預6d后，模型組細胞內p-ERK1、p-ERK2蛋白表達明顯低于空白組（P＜0.05），p-JNK、p-P38蛋白表達明顯高于空白組（P＜0.05），而HSYA各組p-ERK1、p-ERK2蛋白表達明顯高于模型組（P＜0.05），p-JNK、p-P38蛋白表達明顯低于模型組（P＜0.05），且隨著HSYA劑量

14、的增加，細胞內p-ERK1、p-ERK2蛋白表達呈上升趨勢，p-JNK、p-P38蛋白表達呈下降趨勢。
　　結論：
　　1.羥基紅花黃色素A(HSYA)能促進激素性股骨頭缺血壞死模兔股骨頭髓內及離體兔BMSCs內成骨標志物堿性磷酸酶、Cbfα1、Collagen-Ⅰ的表達，抑制成脂標志物甘油三脂的表達，抑制激素誘導股骨頭髓內及離體兔BMSCs成脂分化，促使其成骨分化。
　　2.HSYA通過激活MAPK信號轉導通路，上調