金魚Dishevelled3基因的克隆及其分化表達研究.pdf

1、Dishevelled(DVL/DSH)蛋白在果蠅中被首次發(fā)現(xiàn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，在脊椎動物（包括哺乳動物）基因組中該基因具有Dvl1、Dvl2、Dvl3三種亞型，分別編碼DVL1、DVL2、DVL3三種蛋白。它們均具有DIX、DEP、PDZ三個長度不等進化非常保守的結(jié)構(gòu)域。在果蠅體內(nèi)，散亂蛋白(DVL/DSH)與細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白動態(tài)平衡以及Wnt/β-catenin信號途徑中某些基因的轉(zhuǎn)錄表達有關(guān)。隨著研究人員對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

2、途徑愈加成熟的探究顯示:生物體內(nèi)的散亂蛋白(DVL/DSH)對于Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是不可或缺的組成部分。在Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，DVL是一種連接受體和某些下游信號因子的支架蛋白。
　　在本論文中，我們主要以金魚中的Dvl3基因為研究對象。我們先采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)克隆技術(shù)獲得金魚Dvl3基因的cDNA全長，再分別利用半定量RT-PCR技術(shù)和蛋白免疫印記(Western B

3、lot)技術(shù)分析研究Dvl3基因在mRNA水平和蛋白水平上的表達差異。結(jié)果顯示:(1)Dvl3基因在金魚中cDNA全長具有2063個堿基，CDS區(qū)具有1878個堿基，編碼一個包括626個氨基酸的蛋白質(zhì)。將金魚與其它物種的DVL3氨基酸序列進行對比，結(jié)果顯示:人與其同源相似度是61.3％，非洲爪蟾與其相似度是61.8％，小鼠與其相似度是64.5％，斑馬魚與其相似度是83.8％?？梢钥闯鱿嗨贫缺戎刀驾^高，表明在進化過程中金魚Dvl3基因中擁

4、有較高保守性。(2)經(jīng)過半定量RT-PCR的分析，證明了在不同組織中的mRNA表達水平上，Dvl3基因在金魚卵巢中表達量最高，大腦次之，在心臟、鰓、腎三種組織中的表達水平相對較高，鰭、肌肉、精巢在mRNA水平上的表達相對較低，肝臟中表達最低。在金魚的十二個胚胎發(fā)育時期，在心跳期表達最強，在出膜期中的表達次之，多細(xì)胞、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、視原基、腦泡、肌肉效應(yīng)、體色素及兩細(xì)胞時期表達較高，眼色素時期表達最低。據(jù)此可推測Dvl3基因在金魚

5、不同的組織和胚胎發(fā)育時期中可能起多種重要的作用。(3)提取金魚七個胚胎發(fā)育時期和七種不同組織蛋白，在蛋白水平上，通過半定量Western Blot技術(shù)分析得出:在金魚的7個胚胎發(fā)育時期，Dvl3基因在囊胚期表達最強，在視原基時期的表達次之，神經(jīng)胚、肌效、眼色素、體色素表達相對較高，心跳期表達最低。在金魚的7種組織中，在卵巢中表達最強，在肝臟中表達次之，大腦、精巢中表達相對較低，鰭、鰓、心臟中沒有表達。由此可見散亂蛋白Dvl3在金魚不同的