人類妊娠6～10周絨毛I(xiàn)GF-Ⅱ基因印跡狀態(tài)的研究.pdf

1、在人類胎兒發(fā)育過程中，妊娠3～8周最重要，影響胚胎生長發(fā)育的營養(yǎng)供應(yīng)及傳輸，可導(dǎo)致胚胎的分化異常、流產(chǎn)。自然流產(chǎn)發(fā)生率占全部妊娠10％～15％，多數(shù)為早期自然流產(chǎn)。其病因很多，比較肯定的原因為胚胎染色體異常。 基因印跡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種不遵從孟德爾遺傳定律而依靠單親傳遞某些遺傳學(xué)性狀的現(xiàn)象，即某些基因呈親源依賴性的單等位基因表達(dá)，其另一等位基因不表達(dá)或表達(dá)極弱。具有這樣現(xiàn)象的基因稱為印跡基因(imprintedgene)。目前基

2、因印跡發(fā)現(xiàn)僅存在于哺乳動物，研究推測是生物在長期進(jìn)化過程中形成的一種自我調(diào)控與監(jiān)護機制?；蛴≯E與胚胎形成、胎兒生長及胎盤的分化，產(chǎn)后生長發(fā)育有密切關(guān)系。若印跡功能紊亂將導(dǎo)致多種發(fā)育異常、某些遺傳病和腫瘤的發(fā)生。 胰島素樣生長因子Ⅱ(insulinlikegrowthfactorⅡ，IGF-Ⅱ)是最早發(fā)現(xiàn)的一個印跡基因，具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，調(diào)節(jié)代謝和抗凋亡作用，在胎兒發(fā)育早期有重要的調(diào)控作用，其印跡異常參與某些遺傳病和多種腫瘤

3、的發(fā)生。胰島素樣結(jié)合蛋白(insulinelikegrowthfactorbindingprotein1，IGFBP-1)是IGF的載體蛋白，作為活性調(diào)節(jié)因子調(diào)控IGF與受體結(jié)合，起抑制或增強作用。 有關(guān)基因印跡的研究尚有許多問題難以解釋，如基因印跡的形成與識別機制，父源或母源性印跡基因在生長調(diào)控中是否起相反的作用，對不同種屬胚胎或胚胎外組織的作用等，是遺傳學(xué)與胚胎學(xué)研究的重要課題，有待深入研究。 研究目的： 1

4、.檢測妊娠早期6～10周胚胎發(fā)育異常組和胚胎發(fā)育正常組絨毛組織的IGF-Ⅱ基因印跡狀態(tài)，并進(jìn)行染色體核型分析，探討IGF-Ⅱ基因印跡狀態(tài)與胚胎早期發(fā)育的關(guān)系； 2.檢測胚胎發(fā)育異常組與胚胎發(fā)育正常組母血清IGFBP-1蛋白水平，比較兩組表達(dá)量的差異，探討IGFBP-1與染色體異常的關(guān)系； 3.檢測兩組子宮蛻膜的IGFBP-1mRNA表達(dá)量，蛻膜IGFBP-1mRNA表達(dá)與母血清IGFBP-1蛋白的相關(guān)性，探討IGFBP-

5、1與胚胎發(fā)育異常的關(guān)系。 研究對象及實驗方法 1.研究對象 胚胎發(fā)育異常組(異常組)：在知情同意下收集2002年4月～2004年1月在中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院優(yōu)生遺傳門診、計劃生育門診因胚胎停育而就診的孕婦47例。該組病例經(jīng)B超檢查提示胚胎發(fā)育停止或6周后多次B超觀察未見胚芽，單孕囊，此次妊娠前3個月月經(jīng)規(guī)律，妊娠6～10周，無內(nèi)分泌和腫瘤疾病史，孕期未服用過激素類物。 胚胎發(fā)育正常組(正常組)：同期隨機收集

6、正常單孕囊早孕終止妊娠的38例作為對照組，B超提示胚胎發(fā)育正常，見胚芽及胎心搏動。余條件同異常組。 2.絨毛組織IGF-Ⅱ基因印跡狀態(tài)的檢測：孕婦于吸宮終止妊娠時取絨毛組織提取基因組DNA(gDNA)，進(jìn)行PCR擴增，用ApaI限制性內(nèi)切酶酶切，檢測基因多態(tài)性，選取雜合子(AB型)標(biāo)本進(jìn)行RNA提取，采用逆轉(zhuǎn)錄結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和ApaI限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性檢測兩組雜和子標(biāo)本絨毛組織IGF-Ⅱ基因印跡狀態(tài)。 3.

7、母血清IGFBP-1蛋白檢測：于人流或清宮前肘靜脈采血2ml，注入干燥管內(nèi)，1000r/min離心10min，取上清液用ELISA方法檢測IGFBP-1蛋白含量。 4.子宮蛻膜IGFBP-1mRNA檢測：取蛻膜，RT-PCR檢測組織中IGFBP-1基因mRNA表達(dá)量(以GAPDH作內(nèi)參照)。 實驗結(jié)果： 1.IGF-Ⅱ基因印跡狀態(tài)與胚胎發(fā)育的關(guān)系 研究結(jié)果顯示：胚胎發(fā)育異常組IGF-Ⅱ基因印跡丟失率為42

8、.9％，正常組印跡丟失率為31.6％，兩組間的差異有顯著性(t=2.43，P＜0.05)。 胚胎發(fā)育異常組絨毛染色體異常率為42.5％，在染色體異常標(biāo)本中IGF-Ⅱ基因印跡丟失率高達(dá)52.8％。正常組絨毛染色體核型分析均無異常。兩組間的差異有顯著性(t=3.06，P＜0.05)。提示在染色體異常導(dǎo)致胚胎停育的絨毛組織可能比正常絨毛更容易發(fā)生IGF-Ⅱ的基因印跡丟失。 2.母血清IGFBP-1蛋白水平與胚胎發(fā)育的關(guān)系

9、 胚胎發(fā)育異常組母血清IGFBP-1蛋白含量(56.87±12.08ng/ml)高于胚胎發(fā)育正常組(24.31±3.61ng/ml)，兩組間的差異有顯著性(U=62.10，P＜0.05)。異常組中染色體核型為三體(7例)、三倍體(5例)母血清IGFBP-1蛋白水平異常增高(116.43±34.16)，與正常染色體核型的母血清IGFBP-1蛋白水平(38.89±5.34ng/ml)差異有顯著性(U=97.30，P=0.018)。

10、 3.蛻膜IGFBP-1mRNA表達(dá)與母血清IGFBP-1蛋白關(guān)系 胚胎發(fā)育異常組蛻膜IGFBP-1mRNA表達(dá)(3.76±0.32μg/ml)高于胚胎發(fā)育正常組(2.14±0.21μg/ml)，兩組間的差異有顯著性(U=174.62，P＜0.05)。蛻膜IGFBP-1表達(dá)水平與母血清IGFBP-1蛋白含量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.79)。 結(jié)論 1.妊娠6周～10周胚胎發(fā)育異常組IGF-Ⅱ基因印跡丟失率較正常組增高

11、，尤其是在染色體異常者，提示絨毛I(xiàn)GF-Ⅱ的印跡基因狀態(tài)在胚胎發(fā)育中有重要作用。IGF-Ⅱ的印跡基因丟失可能與染色體異常有關(guān)。 2.妊娠6～10周胚胎發(fā)育異常組母血清IGFBP-1蛋白水平明顯增高，在染色體為三體、三倍體中更甚。母血清IGFBP-1可能作為早期胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測指標(biāo)之一，可能作為早期胚胎篩查多倍體和三體的指標(biāo)之一。 3.母血清IGFBP-1蛋白含量與蛻膜IGFBP-1mRNA表達(dá)有良好相關(guān)性。母血清IGF