深低溫對(duì)全腦缺血性損傷保護(hù)機(jī)制的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)均證實(shí)低溫能減輕腦損傷后病理?yè)p害的程度,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),但其保護(hù)作用的機(jī)制仍未完全明了,一直也是科學(xué)界研究的重點(diǎn).其機(jī)制研究也由生化、代謝水平深入至分子水平,人們開始從分子水平闡述深低溫腦保護(hù)的作用機(jī)制.以往對(duì)深低溫腦保護(hù)的機(jī)理研究主要是單個(gè)蛋白或者基因,利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究深低溫過(guò)程中的全部蛋白質(zhì)的變化尚未見報(bào)道.因此對(duì)于深低溫神經(jīng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜改變的研究非常必要. 本實(shí)驗(yàn)分為兩部分:第一部

2、分:大鼠深低溫和常溫停循環(huán)全腦缺血模型的建立;第二部分:深低溫和常溫全腦缺血大鼠海馬差異蛋白組學(xué)的研究. 第一部分大鼠深低溫和常溫停循環(huán)全腦缺血模型的建立 目的：建立:DHCA(deep hypothermia circulatory arrest,深低溫停循環(huán))和常溫停循環(huán)全腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ? 方法：實(shí)驗(yàn)分成兩組,深低溫缺血組和常溫缺血組(對(duì)照組).取實(shí)驗(yàn)鼠,用3﹪戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定,氣管插管接呼吸機(jī),

3、左腹壁淺動(dòng)脈插管連接監(jiān)測(cè)設(shè)備.然后首先建立CPB(cardiopulmonarybypass,體外循環(huán)),CPB主要由靜脈引流管、貯血器、恒流蠕動(dòng)泵、膜式氧合器及動(dòng)脈輸注管組成;CPB采用股動(dòng)脈灌注、右頸靜脈腔房引流;體外循環(huán)開始后,用熱交換器及體外置冰屑等方法降溫.當(dāng)肛溫降至18℃時(shí)停循環(huán),5min后處死動(dòng)物,取海馬組織.對(duì)照組去除降溫步驟,停循環(huán)5min后處死動(dòng)物,取海馬組織. 結(jié)果：6只大鼠順利建CPB.肛溫達(dá)18℃時(shí)停止

4、降溫,降溫時(shí)間(肛溫從常溫降到18℃)大約8.0±0.5min.CPB期間在降溫的過(guò)程中,分別在33℃、28℃、25℃、22℃、18℃時(shí)記錄各項(xiàng)監(jiān)測(cè)指標(biāo),并且抽取大鼠外周血及頸內(nèi)靜脈血,檢測(cè)血?dú)夥治黾半娊赓|(zhì)等的變化.結(jié)果顯示,降溫過(guò)程中大鼠動(dòng)脈血壓、心率指標(biāo)基本保持正常.血?dú)夥治黾半娊赓|(zhì)等指標(biāo)基本保持平穩(wěn). 結(jié)論：成功地建立了大鼠DHCA和常溫停循環(huán)模型,為下一步深低溫腦保護(hù)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了良好條件. 第二部分

5、深低溫和常溫停循環(huán)全腦缺血大鼠海馬的差異蛋白組學(xué)研究 目的：應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),研究深低溫停循環(huán)和常溫停循環(huán)全腦缺血大鼠海馬組織蛋白質(zhì)的變化. 方法：通過(guò)建立的深低溫停循環(huán)和常溫停循環(huán)模型,取大鼠海馬組織,通過(guò)雙向凝膠電泳、分離蛋白,所得圖譜借助圖像分析軟件lmageMaster 2D Elite進(jìn)行詳細(xì)分析,比較蛋白斑點(diǎn)差異,然后通過(guò)膠內(nèi)酶切、生物質(zhì)譜分析差異的蛋白質(zhì)點(diǎn),鑒定出深低溫過(guò)程中變化的蛋白質(zhì). 結(jié)

6、果：首先利用雙向電泳技術(shù)對(duì)大鼠海馬蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,獲得了較滿意的雙向電泳圖譜.通過(guò)ImageMaster軟件分析報(bào)告發(fā)現(xiàn)有差異的(Ratio值大于1.5)的蛋白考染點(diǎn)14個(gè).通過(guò)對(duì)這些蛋白考染點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,12個(gè)蛋白質(zhì)考染點(diǎn)有實(shí)際意義.鑒定出32個(gè)蛋白質(zhì),其中3個(gè)蛋白質(zhì)重復(fù),實(shí)際的蛋白數(shù)為29個(gè).深低溫停循環(huán)組和常溫停循環(huán)組比較,僅有少數(shù)的蛋白質(zhì)表達(dá)有顯著性差異,這些蛋白依其功能分為不同種類:細(xì)胞骨架蛋白、介導(dǎo)代謝的酶類、參與信號(hào)傳導(dǎo)

7、、參與核酸合成、參與蛋白代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸、功能未知等.其中上調(diào)的蛋白質(zhì)18個(gè),下調(diào)的11個(gè).肌絲蛋白、胞質(zhì)蛋白1、微管蛋白α-1蛋白、微管蛋白β鏈、微管蛋白β-5鏈、特殊Ⅲ級(jí)神經(jīng)元β微管蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前體蛋白等細(xì)胞骨架蛋白呈上調(diào)趨勢(shì),熱休克蛋白、蛋白酶體呈上調(diào)趨勢(shì),二磷酸果糖酶、酪氨酸磷酸酯酶、二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白等與代謝有關(guān)的酶類呈下調(diào)趨勢(shì),蛋白激酶C、神經(jīng)蛋白1蛋白激酶基質(zhì)呈下調(diào)趨勢(shì). 結(jié)論：通過(guò)雙向電泳和質(zhì)譜鑒

8、定,鑒定出了29個(gè)差異蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)既有我們?cè)谖墨I(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道過(guò)的與深低溫腦保護(hù)作用有關(guān)的蛋白質(zhì),如肌絲蛋白、胞質(zhì)蛋白1、微管蛋白α-1蛋白、微管蛋白β鏈、微管蛋白β-5鏈、特殊III級(jí)神經(jīng)元β微管蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前體蛋白等細(xì)胞骨架蛋白、熱休克蛋白、蛋白酶體,他們?cè)谀X保護(hù)作用中的作用機(jī)理已被大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí).通過(guò)我們對(duì)它們的分析,我們從整體上對(duì)深低溫腦保護(hù)的具體機(jī)制有了宏觀理解.同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)一些在深低溫腦保護(hù)中未有過(guò)報(bào)道的未知蛋白,它們的

9、具體作用還有待于進(jìn)一步的研究.全腦缺血后深低溫差異蛋白圖譜中顯示的多個(gè)蛋白的表達(dá)變化說(shuō)明深低溫下神經(jīng)細(xì)胞的變化是非常復(fù)雜的,全腦缺血后深低溫差異蛋白圖譜中顯示的多個(gè)蛋白的表達(dá)變化說(shuō)明深低溫下神經(jīng)細(xì)胞的變化是非常復(fù)雜的,深低溫對(duì)腦組織的保護(hù)作用是肌絲蛋白等細(xì)胞骨架蛋白、熱休克蛋白、蛋白酶體、二磷酸果糖酶等與代謝有關(guān)的酶類、蛋白激酶C等共同作用的結(jié)果,對(duì)深低溫腦保護(hù)的具體作用機(jī)制我們要進(jìn)行全面分析及研究. 總之,本研究通過(guò)建立的深低