2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  建立結(jié)核桿菌急性肺感染的動物模型,探討小鼠肺結(jié)核在感染不同時期的micro-CT(micro-computer tomography)表現(xiàn)及其病理的動態(tài)演變。根據(jù)對不同感染時期肺組織內(nèi)結(jié)核桿菌和宿主的蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果,篩選特異蛋白質(zhì)作為分子靶標(biāo),為制備肺結(jié)核靶向CT造影劑提供理論基礎(chǔ)。
  方法:
  應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株菌懸液以滴鼻法建立C57BL/6J小鼠急性肺結(jié)核模型,同時設(shè)SPF級健

2、康對照組。分別在感染第1、4、8、12周后進(jìn)行micro-CT掃描;經(jīng)心臟灌流后處死小鼠,取1/4肺組織勻漿進(jìn)行結(jié)核桿菌培養(yǎng);1/4肺組織勻漿進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,分別用于篩選結(jié)核桿菌和宿主的分子標(biāo)記物;1/4肺組織-80℃凍存用于RT-PCR(Real time polymerase chain reaction)驗證;余1/4肺組織進(jìn)行組織病理學(xué)分析。
  通過已建立的小鼠肺結(jié)核模型,探討感染不同時期的病理改變及其micro-C

3、T動態(tài)演變特征(正文第一部分重點闡述)。
  采用鳥槍法液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(shotgun liquid chromatography-tandem massspectrometry,shotgun LC-MS/MS)分析肺組織中結(jié)核桿菌的特異蛋白質(zhì):經(jīng)質(zhì)譜分析,搜索結(jié)核分支桿菌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫,得到結(jié)核桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)組。對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行功能學(xué)分類分析,選擇與結(jié)核桿菌生長密切相關(guān)的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁蛋白質(zhì),作為制備靶向造影劑的潛在分子

4、靶標(biāo)(正文第二部分重點闡述)。
  采用二維凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis,2DE)結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)分析肺結(jié)核的差異蛋白質(zhì)組:將獲得4組2DE膠,進(jìn)行圖像差異分析、挖點酶解、質(zhì)譜鑒定并搜索小鼠和結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫,分析差異蛋白質(zhì)的表達(dá)量在不同感染時間點的變化,篩選用于結(jié)核病特異診斷的分子靶標(biāo),并進(jìn)行Western Blot和RT-PCR驗證(正文第三部分重點闡述)。

5、r>  結(jié)果:
  1.攻毒40只小鼠,共計死亡9只,肺內(nèi)未出現(xiàn)陽性病灶者3只,剔除實驗組,實際第1、2、3、4組每組實驗小鼠數(shù)目分別為7只、6只、8只、7只,共28只。
  2.micro-CT——病理對照分析:感染1周后,急性感染造成大面積肺泡滲出,micro-CT表現(xiàn)為大片磨玻璃密度影,鏡下見肺泡間隔增寬,淋巴細(xì)胞浸潤為主,散在中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和類上皮細(xì)胞;感染4周后,鏡下可見巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞大量聚集,散在類上皮

6、細(xì)胞、多核巨細(xì)胞和泡沫細(xì)胞,micro-CT表現(xiàn)為大小不等斑片樣實變,邊界不清;感染8周后,實變范圍增大,類上皮細(xì)胞增多,開始出現(xiàn)多核巨細(xì)胞聚集成團,有結(jié)核肉芽腫形成趨勢;感染12周后,滲出減少、多發(fā)孤立的肉芽腫形成,或者病變范圍進(jìn)一步進(jìn)展。感染1、4、8、12周后肺內(nèi)結(jié)核桿菌培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果分別為(單位:log10 cfu):6.30±0.02,6.61±0.40,6.38±0.25,4.52±0.32。
  3.鳥槍法LC-MS/

7、MS蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果:感染4、8、12周的肺結(jié)核蛋白質(zhì)樣本鑒定出的蛋白質(zhì)分別為102,101,90個,共計237個蛋白質(zhì)(根據(jù)病理分析,感染1周時肺內(nèi)為非特異性滲出,故未計入)。在組間重復(fù)表達(dá)的有43個,占18.2%,其中3個時間點均存在的蛋白質(zhì)有11個,感染4周和8周重復(fù)鑒定的蛋白質(zhì)12個,感染8周和12周重復(fù)鑒定20個,而感染4周和感染12周僅重復(fù)鑒定出2個。重復(fù)鑒定出的蛋白質(zhì)按功能分類,第7類(細(xì)胞代謝中間產(chǎn)物)最多;其次是第2

8、類(信號通路蛋白)和第9類(調(diào)控蛋白)。選擇其中感染8周和感染12周重復(fù)表達(dá)且為細(xì)胞膜蛋白質(zhì),近年來備受關(guān)注的第9類蛋白質(zhì)中的結(jié)核分支桿菌雙因子系統(tǒng)中的MtrB進(jìn)行重點研究,發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌的膜蛋白質(zhì)MtrB可以成為制備結(jié)核靶向造影劑的潛在靶標(biāo)。
  4.分析4組2DE膠,感染第1、4、8、12周得到的差異表達(dá)的蛋白質(zhì)膠點數(shù)目分別為11個,154個,254個和30個,各組間差異點重疊性分析,在4組間,3組間,和兩組間均為差異表達(dá)的蛋白

9、質(zhì)膠點分別為0個,14個和75個。
  選取了145個表達(dá)差異點進(jìn)行膠內(nèi)酶解,將MS/MS的結(jié)果搜小鼠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,145個蛋白質(zhì)點對應(yīng)了82種準(zhǔn)確鑒定的非冗余蛋白質(zhì)。對82種蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖分析得出節(jié)點蛋白質(zhì)有:Alb,Vim,Actb, Fthl,Tnnt3,F(xiàn)tl,Msn等;結(jié)合二維凝膠電泳分析的差異倍數(shù)比較并查閱文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)鐵蛋白H鏈和L鏈在感染1周時無差異表達(dá),在感染4、8、12周時均有表達(dá)上調(diào),且呈拋物線

10、式上調(diào)表達(dá),在感染8周時達(dá)到峰值。
  5.將2DE-MS/MS分析得到的結(jié)果,搜結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,鑒定得到評分大于36分的僅7種蛋白質(zhì),包括:SYA,CP126,HTPG,Y224,SMC,ACEA。
  結(jié)論:
  1.滴鼻法建立的C57BL/6J小鼠急性感染肺結(jié)核動物模型,肺活菌計數(shù),micro-CT和組織病理學(xué)結(jié)果均表明模型制備成功。
  2.急性小鼠肺結(jié)核模型的肺部micro-CT表現(xiàn)隨疾病發(fā)展有一

11、定的變化規(guī)律:早期大片GGO——大小不等實變灶——大范圍實變和較大、邊界不清的結(jié)節(jié)(肉芽腫)——實變進(jìn)一步發(fā)展,或?qū)嵶冇兴眨瑑H散在多個小結(jié)節(jié)。這些征象反映了小鼠肺結(jié)核病理改變,可用于監(jiān)測小鼠肺結(jié)核的病程,提示在未來的結(jié)核動物實驗中可減少小鼠不必要的處死。
  3.活體組織內(nèi)初步篩選出結(jié)核分支桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)MtrB(Rv3245c)可作為制備CT靶向造影劑的潛在分子靶標(biāo),為抗MtrB鼠單克隆抗體制備靶向CT對比劑的制備及動物模

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