基因芯片篩選和分析As-,2-O-,3-誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡相關(guān)基因.pdf

1、[目的] 研究三氧化二砷(As2O3)對(duì)人類(lèi)急性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡以及其周期的影響，篩選As2O3誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，探討As2O3抗腫瘤可能作用機(jī)制。 [方法] 用含有不同濃度As2O3的培養(yǎng)基培養(yǎng)NB4細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)As2O3對(duì)NB4細(xì)胞增殖的抑制作用，利用流式細(xì)胞儀通過(guò)AnnexinVFITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期，分別用CELLQue

2、st和MODIFit2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀(guān)察As2O3對(duì)NB4細(xì)胞凋亡的及細(xì)胞周期的影響。為深入研究As2O3對(duì)NB4細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡時(shí)所涉及到的凋亡相關(guān)基因，抽提4μmol/1As2O3作用24h的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞的mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄將細(xì)胞cDNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，用美國(guó)Superarray公司的含269個(gè)目的基因的細(xì)胞凋亡和周期基因芯片進(jìn)行雜交，GEArray軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出

3、As2O3誘導(dǎo)前后表達(dá)有差異的基因，用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性。對(duì)獲得的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能的機(jī)制。 [結(jié)果] ①1～8μmol/LAs2O3能顯著抑制NB4細(xì)胞增殖，且這些變化呈明顯的時(shí)間和濃度依賴(lài)關(guān)系(時(shí)間-劑量效應(yīng))；②2、4、8μmol/LAs2O3作用于NB4細(xì)胞可以引起不同程度的細(xì)胞凋亡，與凋亡并行出現(xiàn)的是程度不等的G2/M期細(xì)胞周期阻滯。As2O3處理時(shí)間為12

4、h和24h其早期凋亡率和總凋亡率均與劑量呈線(xiàn)性正相關(guān)；As2O3處理時(shí)間為36h和48hNB4細(xì)胞以中晚期凋亡為主。不同濃度的As2O3使NB4細(xì)胞周期阻滯在G2/M期；③用細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期基因芯片雜交篩選出4μmol/lAs2O3作用24h后兩組細(xì)胞中表達(dá)有差異的基因共100條(占芯片基因總數(shù)的37.2％)，其中97條(97/100，97％)基因表達(dá)上調(diào)，3條(3/100，3％)基因表達(dá)下調(diào)。表達(dá)上調(diào)的基因主要包括腫瘤壞死因子配體和

5、受體家族、半胱氨酸家族、Bcl-2家族、DNA損傷檢測(cè)和P53途徑和細(xì)胞分裂周期蛋白和激酶等；④實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果基本相符，說(shuō)明基因芯片結(jié)果可信度較高，實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)Bcl-2表達(dá)下調(diào)(在芯片結(jié)果中表達(dá)沒(méi)有變化)。 [結(jié)論] 1)As2O3對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)抑制呈時(shí)間-劑量關(guān)系，這種效應(yīng)與引起細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯(G2/M期)有關(guān)； 2)通過(guò)對(duì)基因芯片上表達(dá)水平發(fā)

6、生改變基因的分析推測(cè)，As2O3誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡是多種途徑共同作用的結(jié)果，其中Fas和Caspase途徑通路上的基因以及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因可能發(fā)揮了主要作用； 3)發(fā)現(xiàn)了三條(BAl1、BAI2和VEGI)與抑制血管增生有關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，充實(shí)了As2O3通過(guò)抑制血管增生發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的分子機(jī)理； 4)As2O3促進(jìn)細(xì)胞凋亡的同時(shí)有部分促存活的基因表達(dá)上調(diào)可部分解釋As2O3既可作為抗腫瘤藥物又具有致癌性，也可為臨