脂聯(lián)素在糖尿病腎病中的保護作用及相關(guān)機制的實驗研究.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病常見又嚴重的并發(fā)癥之一，它是以腎小球系膜細胞增生，細胞外基質(zhì)增多，腎小球基底膜增厚等病理生理改變及腎小球硬化為主要特征的病變。其發(fā)病機制復(fù)雜，與腎小球血流動力學改變、生化代謝紊亂，氧化應(yīng)激，細胞因子、遺傳易感性等多種因素有關(guān)。DN預(yù)后差，相比其它原因所致的腎臟疾病更難以治療，其原因尚不清楚。研究表明，細胞因子分泌增多，細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白代謝異常在DN發(fā)病機制的各

2、個環(huán)節(jié)起著重要作用，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是一個重要的細胞因子，它的異常表達在ECM代謝過程中發(fā)揮重要的作用，可直接或間接促進ECM成分增加，是導(dǎo)致糖尿病患者腎臟纖維化的最后共同中介物質(zhì)。此外，近來越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激(oxidativestress,OS)在糖尿病腎病發(fā)病中起重要作用；糖尿病狀態(tài)下由于活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生增多和/或清除減少導(dǎo)致了氧化應(yīng)激狀態(tài)。R

3、OS本身可攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致腎臟損害。
　　 脂聯(lián)素(adiponectin,ADPN)是一種由白色脂肪組織分泌的蛋白產(chǎn)物，是脂肪組織在人血漿分泌最多的蛋白。脂聯(lián)素又稱30kD脂肪細胞補體相關(guān)蛋白(Acrp30)或28kD膠原結(jié)合蛋白(GBP28)，人類脂聯(lián)素基因由apM1 mRNA編碼，位于染色體3q27上，全長16Kb，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成。自從1995年發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素以來，多項研究已證實脂聯(lián)素具有抗炎、改善

4、胰島素抵抗、抗動脈粥樣硬化、降血糖、血脂等作用，最近研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素還具有抗氧化作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)血漿ADPN濃度與糖尿病腎病關(guān)系密切。對早期糖尿病腎病的研究顯示循環(huán)脂聯(lián)素水平與尿蛋白呈負相關(guān)，說明早期糖尿病腎病內(nèi)皮功能受損與低脂聯(lián)素水平有關(guān)；進展期糖尿病腎病患者尿脂聯(lián)素和血脂聯(lián)素水平增加，認為其可能通過抗炎、抗動脈硬化等作用，減輕腎臟損害。然而脂聯(lián)素對糖尿病腎病保護作用的機理研究甚少。因此我們在體外將脂聯(lián)素作用于高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細

5、胞，觀察其對細胞增殖、TGF-β1、活性氧簇(ROS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)產(chǎn)生的影響，并對其相關(guān)信號通路進行探討；同時構(gòu)建表達ADPN的pIRES2-EGFP-gAd熒光質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染糖尿病大鼠模型，探討其對腎臟的保護作用與機理。本研究的目的、方法、結(jié)果、結(jié)論分三部分概述如下：
　　 第一章、脂聯(lián)素對系膜細胞氧化應(yīng)激和TGFβ1的影響及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究
　　 目的：觀察脂聯(lián)素對高糖誘導(dǎo)下腎小球系膜細胞RO

6、S、eNOS以及TGF-β1產(chǎn)生的影響，并探討腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路在這一過程中的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞(HMCs)，RT-PCR檢測HMCs脂聯(lián)素受體(adiponectin receptor,AdipoR)mRNA的表達。分別用高糖(30mM)和不同濃度(3-10ug/ml)重組人球形脂聯(lián)素蛋白干預(yù)HMCs24、36小時，MTT試驗觀察細胞增殖情況。將細胞隨機分為4組：對照組、高糖組(3

7、0mM)、高糖＋脂聯(lián)素組和高糖＋脂聯(lián)素＋AMPK抑制劑araA(adenine9-β-D-arabinfuranoside)組，觀察脂聯(lián)素對高糖誘導(dǎo)的HMCs氧化應(yīng)激和TGF-β1 mRNA和蛋白表達的影響。熒光探針檢測ROS釋放；RT-PCR檢測eNOS和TGF-β1 mRNA表達，Western blot檢測eNOS和TGF-β1蛋白水平。另外，為了進一步明確脂聯(lián)素上述作用的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，用脂聯(lián)素10ug/ml單獨干預(yù)系膜細胞，

8、分別于0、5、10、15、30min提取胞漿蛋白，Western blot檢測磷酸化AMPK蛋白(p-AMPK)表達。
　　 結(jié)果：1)RT-PCR證實人腎小球系膜細胞上有AdipoR1和AdipoR2表達，半定量結(jié)果示AdipoR1明顯占優(yōu)勢（AdipoR1的表達強度是AdipoR2的3.5倍）；2)脂聯(lián)素呈時間和劑量依賴性地抑制高糖刺激下的HMCs增殖；3)Western blot檢測p-AMPK蛋白證實脂聯(lián)素可以時間依賴的

9、方式誘導(dǎo)系膜細胞AMPK磷酸化；4)高糖組HMCs的ROS釋放量較對照組明顯增加，eNOS產(chǎn)生減少，TGF-β1表達上調(diào)(p＜0.05)；脂聯(lián)素處理后ROS產(chǎn)生量較高糖組明顯減少，eNOS表達上調(diào)，TGF-β1產(chǎn)生減少(p＜0.05)；加入AMPK抑制劑araA后，可部分抑制脂聯(lián)素的上述作用。
　　 結(jié)論：1、脂聯(lián)素能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HMCs增生和活性氧產(chǎn)生，促進eNOS產(chǎn)生，下調(diào)TGF-β1的表達，從而對抗高糖對系膜細胞的損傷

10、。
　　 2、脂聯(lián)素可刺激系膜細胞AMPK通道開放，脂聯(lián)素對HMCs的保護作用部分是通過脂聯(lián)素受體介導(dǎo)AMPK信號通路實現(xiàn)的。
　　 第二章、表達ADPN的pIRES2-EGFP-gAd質(zhì)粒載體的構(gòu)建及其在大鼠腎臟的表達
　　 目的：構(gòu)建表達脂聯(lián)素的pIRES2-EGFP-gAd質(zhì)粒，觀察其在大鼠腎臟的表達，為體內(nèi)觀察脂聯(lián)素對糖尿病大鼠模型的腎臟影響奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：根據(jù)GENBANK中人脂聯(lián)素的c

11、DNA編碼球形結(jié)構(gòu)域(gAd)的序列設(shè)計引物，以已有的pET/gAd質(zhì)粒（編碼脂聯(lián)素球形結(jié)構(gòu)域的細菌表達質(zhì)粒，gAd基因克隆于pET-15b載體的多克隆位點，長440bp）為模板，PCR擴增目的片段，連接T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用EcoRI和BanHI雙酶切后，與pIRES2-EGFP熒光質(zhì)粒連接，重組構(gòu)建pIRES2-EGFP-gAd質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的pIRES2-EGFP-gAd質(zhì)粒采用脂質(zhì)體介導(dǎo)經(jīng)腹腔注射正常大鼠體內(nèi)，然后在不同時間

12、點(24h、48h、96h、7d)留取腎臟標本進行冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在腎組織中的表達情況，同時采用Western Blot檢測腎皮質(zhì)綠色熒光蛋白的表達。
　　 結(jié)果：1)重組構(gòu)建的pIRES2-EGFP-gAd載體經(jīng)雙酶切電泳分析及DNA測序證實無堿基突變。2)在腹腔注射脂質(zhì)體/pIRES2-EGFP-gAd轉(zhuǎn)染復(fù)合物后24h，熒光顯微鏡下觀察，即可在腎小球腎間質(zhì)檢測到綠色熒光蛋白的表達，在注射后48h熒光

13、強度進一步增強，隨著給藥時間的延長，綠色熒光蛋白在腎臟的表達逐漸減少，在注射后第7d時，雖然仍能檢測到綠色熒光蛋白的表達，但熒光強度明顯減弱。Western Blot檢測EGFP蛋白結(jié)果與冰凍組織切片結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：脂質(zhì)體能夠介導(dǎo)pIRES2-EGFP-gAd真核載體在大鼠腎臟表達，實驗中將能發(fā)出綠色熒光的EGFP報告基因融合在gAd基因的3′端，既保留了gAd的生物活性，又便于基因治療中可檢測到蛋白表達，為探討脂聯(lián)素在

14、DN中的作用提供實驗?zāi)Ｐ偷於ɑA(chǔ)。
　　 第三章、復(fù)制DM模型研究脂聯(lián)素對腎臟的保護作用及機制
　　 目的：研究脂聯(lián)素對糖尿病大鼠的腎臟保護作用及其相關(guān)機制。
　　 方法：采用高糖高脂飲食配合腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法復(fù)制糖尿病大鼠模型。將32只Wistar大鼠隨機分為正常對照組（NC組）、糖尿病組（DM組）、ADPN干擾組（DA組）和空載體轉(zhuǎn)染組(DP)，其中DA、DP組分別腹腔注射脂質(zhì)體/pIRES2

15、-EGFP-gAd或脂質(zhì)體/pIRES2-EGFP復(fù)合物。處理8周后，觀察血糖、糖化血紅蛋白(HbAlc)、24h尿微量白蛋白(UMA)變化；留取腎組織切片觀察光鏡下的病理改變并測定腎組織ROS釋放量的變化；熒光定量RT-PCR檢測各組大鼠腎組織eNOS、TGF-β1的基因轉(zhuǎn)錄水平，采用免疫組化法檢測eNOS、TGF-β1、p-AMPK蛋白的表達水平。
　　 結(jié)果：與正常對照組比較，DM模型組大鼠UMA顯著上升，腎組織ROS釋放

16、量增加(P＜0.05)，DM、DA、DP各組之間UMA無明顯差異(P＞0.05)。與DM組相比，DA組血糖和HbAlc有所下降，ROS釋放明顯減少(P＜0.05)。光鏡下DM組大鼠大部分腎小球系膜區(qū)增寬，基質(zhì)大量增生，節(jié)段性基底膜增厚、部分腎小管上皮細胞空泡變性、脫落，腎小球內(nèi)細胞數(shù)顯著增多、單個核細胞浸潤明顯，與DM組相比，脂聯(lián)素干預(yù)組以上病變均有減輕。與對照組相比DM組腎組織eNOS水平下降，TGF-β1表達明顯上調(diào)，p-AMPK蛋