類甜蛋白基因參與TcLr35小麥成株抗葉銹病反應的功能分析.pdf

1、類甜蛋白（Thaumatin-like protein，TLP）是一類具有多種生物學活性及重要功能的植物防御蛋白，在植物抗病防御反應中起著重要的作用。為此，在前期研究基礎(chǔ)上，現(xiàn)進一步驗證已克隆類甜蛋白基因TaLr35PR5參與Lr35基因介導的成株抗葉銹病防御反應的功能。首先，SignalP4.0預測TaLr35PR5蛋白的前20個氨基酸是典型的信號肽結(jié)構(gòu)，推測TaLr35PR5蛋白可能是胞外蛋白，并通過酵母信號肽分泌系統(tǒng)加以驗證;同時

2、，利用洋蔥表皮細胞瞬時轉(zhuǎn)化試驗對該基因進行了亞細胞定位分析;利用VIGS技術(shù)進一步明確該基因在小麥抗葉銹病防御反應中的功能。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.克隆TaLr35PR5基因信號肽，并構(gòu)建酵母信號肽誘捕重組載體pSUC2-TaLr35PR5，將其轉(zhuǎn)化至酵母缺陷型菌株YTK12，在雙糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)酵母對雙糖的利用情況來鑒定信號肽的分泌功能。含有pSUC2-TaLr35PR5的酵母克隆可以在蔗糖與棉籽糖培養(yǎng)基上生長，并

3、且能與TTC產(chǎn)生顏色反應，表明TaLr35PR5信號肽具有分泌活性。
　　2.利用基因槍法將重組載體pCamA-TaLr35PR5-GFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞進行融合蛋白的亞細胞定位，以pCamA-GFP為對照。熒光顯微鏡下觀察到對照蛋白在整個細胞中均有表達，而融合蛋白明顯分布在胞外區(qū)域，推斷該蛋白可能是通過信號肽分泌到胞外來執(zhí)行其防御功能。
　　3.采用BSMV-VIGS技術(shù)對TaLr35PR5基因進行功能分析。接種攜帶沉默基