抗葉銹病相關(guān)基因TaEFR1的克隆及功能研究.pdf

1、小麥葉銹菌引起的葉銹病是小麥上最為常見(jiàn)的病害之一，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可對(duì)小麥產(chǎn)量產(chǎn)生巨大影響。篩選高效抗病基因，并明確其抗病機(jī)制是控制小麥葉銹病的重要手段。植物體中存在著的富亮氨酸重復(fù)類(lèi)受體蛋白激酶(Leucine-rich repeat receptor-like kinases，LRR-RLKs)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗病反應(yīng)有重要作用，然而該類(lèi)基因的功能在小麥中的研究報(bào)道還相對(duì)匱乏。本試驗(yàn)基于實(shí)驗(yàn)室近期獲得的RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選得到1個(gè)在

2、接種葉銹菌后相對(duì)表達(dá)量顯著變化的屬于LRR-RLKs的Unigene。利用同源克隆技術(shù)在小麥(Triticum aestivum L.)品種TcLr26中獲得其同源基因，根據(jù)該基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，命名為T(mén)aEFR1。本試驗(yàn)以小麥近等基因系TcLr26和Thatcher分別與葉銹菌生理小種260組成不親和與親和組合，在不親和組合中表現(xiàn)典型的細(xì)胞過(guò)敏性死亡(Hypersensitive reaction，HR)現(xiàn)象。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(R

3、T-qPCR)技術(shù)對(duì)TaEFR1基因接菌后不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了分析;通過(guò)VIGS(Virus induced gene silencing，VIGS)技術(shù)在TcLr26中降低其轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，初步推測(cè)了TaEFR1基因可能參與小麥抵抗葉銹菌的抗病反應(yīng)。所得主要結(jié)果如下:
　　1.基于RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選得到1個(gè)在接種葉銹菌后較0h相對(duì)表達(dá)量明顯變化的屬于LRR-RLKs的Unigene，從小麥TcLr26中同源克隆獲得

4、其同源基因的CDS全長(zhǎng)。生物信息學(xué)分析該基因編碼蛋白為913個(gè)氨基酸，其蛋白結(jié)構(gòu)包含1個(gè)信號(hào)肽，胞外存在9個(gè)LRRs結(jié)構(gòu)域，1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)胞內(nèi)絲/蘇氨酸激酶域。
　　2.利用RT-qPCR檢測(cè)接種葉銹菌后TaEFR1基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式，結(jié)果表明，接種葉銹菌后早期，不親和組合中該基因被誘導(dǎo)表達(dá)，于8h達(dá)到峰值，然后基因表達(dá)量下降，在接菌后24h該基因再次被誘導(dǎo)表達(dá)，且其表達(dá)量出現(xiàn)回升趨勢(shì);而親和組合中變化趨勢(shì)與不親和組合相似，

5、但表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于不親和組合，初步證明TaEFR1基因參與了小麥抵抗葉銹菌侵染的過(guò)程。
　　3.通過(guò)VIGS技術(shù)，在TcLr26中沉默TaEFR1基因，接種葉銹菌生理小種260后，發(fā)現(xiàn)HR面積擴(kuò)大，HMC數(shù)量增多，意味著沉默TaEFR1基因后小麥對(duì)葉銹菌的抗性降低，葉銹菌更容易侵染寄主細(xì)胞。上述結(jié)果表明TaEFR1基因在小麥抵抗葉銹菌侵染誘發(fā)的防衛(wèi)反應(yīng)中，起到重要的正調(diào)控作用。
　　4.構(gòu)建TaEFR1基因的亞細(xì)胞定位載體使T

6、aEFR1與GFP蛋白融合表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TaEFR1蛋白在細(xì)胞膜系統(tǒng)上表達(dá)，且主要在質(zhì)膜和核膜上表達(dá)。
　　5.小麥TcLr26外源噴施SA后，TaEFR1基因被誘導(dǎo)表達(dá)，揭示TaEFR1基因可能參與了SA信號(hào)通路，并在SA信號(hào)下游發(fā)揮作用。
　　6.對(duì)小麥TcLr26葉片預(yù)注射EGTA，再接種葉銹菌生理小種260，RT-qPCR結(jié)果顯示，TaEFR1基因的表達(dá)水平被EGTA強(qiáng)烈抑制，表明該基因參與了Ca2+信號(hào)通路，并在Ca2

7、+下游發(fā)揮作用。
　　7.不同近等基因系小麥品種接種葉銹菌生理小種260后，在三個(gè)不親和組合中(TcLr1、TcLr19和TcLr21接種葉銹菌)，TaEFR1基因的表達(dá)模式不同。對(duì)于TcLr1和TcLr21來(lái)說(shuō)，該基因參與了基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)PTI的誘發(fā)，同時(shí)可能也介導(dǎo)了抗葉銹基因Lr1或Lr21誘發(fā)的防衛(wèi)反應(yīng)。在TcLr19形成的不親和組合中，該基因參與了基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)PTI的誘發(fā)，但在抗葉銹基因Lr19誘發(fā)的防衛(wèi)反應(yīng)中沒(méi)有發(fā)揮主要作