uPA-uPAR在皮膚上皮化-再上皮化過程中表達(dá)及作用的初步研究.pdf

1、蛋白水解酶的水解過程對(duì)于正常的生理功能是必需的，包括正常的血管維持，血管的形成，凝塊的形成和溶解，骨的重塑以及排卵等。這些酶系統(tǒng)的上述作用同樣適用于癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，通過降解基底膜以及細(xì)胞外基質(zhì)，以利于細(xì)胞的遷移。降解胞外基質(zhì)的蛋白水解酶主要包括三種：基質(zhì)金屬蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶以及絲氨酸蛋白酶。其中絲氨酸蛋白酶中的uPA系統(tǒng)起著重要的作用。 在uPA系統(tǒng)中，uPA/uPAR作用更為重要。以往的研究表明，uPA/uPAR在正

2、常皮膚中無表達(dá)，但在皮膚的腫瘤組織以及創(chuàng)傷后表達(dá)強(qiáng)烈。但以往的研究對(duì)uPA/uPAR在胚胎發(fā)育期的情況以及功能方面研究較少；在創(chuàng)傷愈合過程的早期，uPAR表達(dá)強(qiáng)烈，但其作用如何，以往文獻(xiàn)未見報(bào)道。 因此，本研究以u(píng)PA/uPAR為研究對(duì)象，首先，通過免疫組織化學(xué)以及原位雜交技術(shù)研究uPA/uPAR在胚胎發(fā)育期皮膚及毛囊的表達(dá)情況；由于人體研究的局限性，通過構(gòu)建含uPAATF以及uPAR的綠色熒光蛋白，并分別轉(zhuǎn)染到小鼠永生化細(xì)胞株

3、Pam212，分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞增殖遷移的影響；將構(gòu)建的綠色熒光蛋白經(jīng)注射、電穿孔后觀察對(duì)在體小鼠創(chuàng)傷愈合的影響。主要結(jié)果如下： 1、采用免疫組織化學(xué)及原位雜交技術(shù)檢測(cè)在胚胎發(fā)育期皮膚及毛囊中uPA的表達(dá)情況。以往我們的研究表明，在胚胎發(fā)育期皮膚和毛囊中有uPAR蛋白及mRNA的表達(dá)。uPA與uPAR一般相伴而生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)在胚胎發(fā)育期的表皮及毛囊中有uPA的表達(dá)；(2)在毛囊發(fā)育的起始階段，uPA蛋白及mRNA主要在表

4、皮的基底層、最外層、皮上層以及毛囊芽中表達(dá)；在延長(zhǎng)期，在表皮的表達(dá)與起始階段相似，在毛囊的最外層有表達(dá)；在球形毛囊釘期和分化的階段早期，表皮的基底層以及毛囊的外根鞘中有表達(dá)，并且在毛囊隆突區(qū)也有著色，而在胚胎晚期未檢測(cè)到表達(dá)。(3)uPA的表達(dá)強(qiáng)度表現(xiàn)為逐漸升高，而在分化期表達(dá)較高，然后降低，直至未能檢測(cè)到。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在胚胎發(fā)育期的正常皮膚及其附屬器毛囊中有uPA/uPAR的表達(dá)，并且推測(cè)表達(dá)與表皮及毛囊細(xì)胞的增殖、遷移相關(guān)。

5、 2、采用質(zhì)粒構(gòu)建，將uPAATF片斷構(gòu)建到綠色熒光蛋白質(zhì)粒中，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠永生化細(xì)胞株P(guān)am212細(xì)胞中，通過MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)來觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染uPAATF質(zhì)粒后，形成的uPAATF蛋白能抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且降低了細(xì)胞的侵襲能力。 3、采用質(zhì)粒構(gòu)建，將全長(zhǎng)的uPAR片斷構(gòu)建到綠色熒光蛋白質(zhì)粒中，再轉(zhuǎn)染到Pam212細(xì)胞中，通過MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)

6、細(xì)胞活性，Transwell檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染含uPAR質(zhì)粒后，促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且提高了細(xì)胞的侵襲能力。 4、將提取的無內(nèi)毒素的質(zhì)粒，注射到創(chuàng)傷的小鼠皮下，通過電轉(zhuǎn)移法，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，通過綠色熒光觀察，創(chuàng)面愈合率的測(cè)定，HE、Masson染色，組織形態(tài)學(xué)的觀察，以及創(chuàng)傷面羥脯氨酸和蛋白含量的測(cè)定。結(jié)果表明：(1)電轉(zhuǎn)移法是實(shí)用可行的一種物理轉(zhuǎn)移的方法，是基因治療的一種新手段；(2)轉(zhuǎn)染uPAR質(zhì)粒合成的

7、蛋白位于創(chuàng)傷面角質(zhì)形成細(xì)胞的前沿；(3)轉(zhuǎn)染uPAR質(zhì)粒的創(chuàng)傷愈合率高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和uPAATF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；(4)Masson染色顯示轉(zhuǎn)染uPAR質(zhì)粒新合成膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密，優(yōu)于對(duì)照組和uPAATF組；(5)肉芽組織膠原蛋白及羥脯氨酸含量變化不大，可能與新生肉芽組織含水量較高有關(guān)?？傊?，創(chuàng)傷后轉(zhuǎn)染uPAR質(zhì)粒，能促進(jìn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移增殖。 綜上所述，本課題表明，在人胚胎發(fā)育期皮膚及毛囊中有uPA蛋白及mRNA的表達(dá)，以往