唐魚二種不同長度β-actin基因啟動調(diào)控序列的分離及其轉(zhuǎn)錄驅(qū)動活性的比較分析.pdf

1、β肌動蛋白(B-actin)基因為管家基因，其啟動子具有廣泛啟動表達功能。β-actin啟動子具有與SV40早期啟動子相當(dāng)甚至更強的啟動轉(zhuǎn)錄活性，因此成為轉(zhuǎn)基因研究的重要啟動子之一。唐魚(Tanichthys albonubes Lin)是我國特有的小型鯉科魚類，具有較高的觀賞價值。本實驗分離了二種不同長度的唐魚β-actin啟動子序列，分別構(gòu)建了紅色熒光蛋白表達載體，同時利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，檢測比較二種啟動調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄啟動功能，以期獲得

2、具有強啟動功能的唐魚β-actin啟動子，為唐魚的自源功能基因轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ)，同時獲得具有更高觀賞價值的轉(zhuǎn)紅色熒光蛋白基因唐魚。主要研究內(nèi)容如下： 1.利用高保真PCR技術(shù)克隆了唐魚、斑馬魚(Danio rerio)和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)β-actin基因的5'端側(cè)翼區(qū)啟動調(diào)控區(qū)及部分開放閱讀框。測序結(jié)果表明，所克隆的三種魚β-actin基因片段長度分別為1464bp、1654bp和1733bp

3、，包含長為1.3kb、1.5kb及1.6kb的啟動調(diào)控區(qū)以及90bp的部分開放閱讀框。啟動調(diào)控區(qū)均包括一段長約為105bp的B-actin近端啟動子以及β-actin基因第一個不翻譯的外顯子和第一個內(nèi)含子。BLAST結(jié)果顯示，此開放閱讀框片段所編碼的30個氨基酸具有高度的保守性，其中唐魚與斑馬魚的同源性為100％；與尼羅羅非魚的同源性為96.7％。在5'端的非翻譯區(qū)含有與大多數(shù)魚類相同的與轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的幾個轉(zhuǎn)錄元件：CAAT box、C

4、ArG box和TATA box，其位置分別在轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)上游的-89，-59，-26處左右。 2.通過基因重組，將所獲得的唐魚和斑馬魚β-actin基因啟動子定向克隆到不含啟動子的紅色熒光蛋白(RFP)表達載體pDsRed2-1的多克隆位點上，分別構(gòu)建RFP表達載體pTA-DsRed和pZA-DsRed。采用顯微注射法將線性化的重組表達載體分別注射到唐魚的受精卵中，利用熒光顯微鏡觀察外源基因RFP在唐魚中的表達。結(jié)果表

5、明RFP在轉(zhuǎn)pTA-DsRed基因唐魚表達的陽性率較高，平均為36.4％，且RFP的表達水平較高，有些孵化出膜72h的仔魚整個軀干都可見紅色熒光。RFP在轉(zhuǎn)pZA-DsRed基因唐魚中的表達水平較轉(zhuǎn)pTA-DsRed基因唐魚的低，其陽性率平均為16.9％，極顯著低于轉(zhuǎn)pTA-DsRed基因唐魚(P<0.01)。 3.采用PCR、RT-PCR以及Southern blot等技術(shù)對肉眼可見紅色熒光的2尾4月齡轉(zhuǎn)pTA-DsRed基

6、因唐魚外源基因的整合和表達情況進行了檢測。轉(zhuǎn)基因唐魚眼、肌、鰭及內(nèi)臟等的基因組DNA進行RFP基因的PCR擴增及擴增產(chǎn)物的 Southern blot檢測，結(jié)果在所檢測的組織器官中均能檢測到RFP基因；而采用RT-PCR技術(shù)以及Southem blot驗證顯示其中一個體所檢測的組織器官均有RFP的表達，另一個體在除鰭外的其他組織器官也均有表達；Southern blot檢測肌肉組織基因組DNA顯示有比陽性載體分子大的雜交條帶，未檢測到小

7、分子雜交帶。實驗表明在所檢測的組織中已發(fā)生外源基因RFP的整合，但在有些組織中存在表達水平較低或者不表達的現(xiàn)象。 4.應(yīng)用基因組步移(Genome Walker)技術(shù)，根據(jù)已獲得的1.3kb的唐魚β-actin基因啟動子序列，進一步分離到唐魚β-actin基因5'側(cè)翼長為1.7kb的遠端啟動子序列，最終獲得總長度為3.0kb的唐魚β-actin基因啟動調(diào)控序列。將其定向克隆到不含啟動子的RFP表達載體pDsRed2-1中，構(gòu)建了

8、重組RFP表達載體pTLA-DsRed，采用顯微注射法將線性化的重組表達載體注射到唐魚的受精卵中，利用熒光顯微鏡觀察外源基因RFP在唐魚中的表達。結(jié)果顯示RFP在轉(zhuǎn)pTLA-DsRed基因唐魚表達的陽性率較高，平均為35.1％，在有些剛出膜的轉(zhuǎn)pTLA-DsRed基因唐魚體表肉眼即可觀察到紅色熒光，在熒光顯微鏡下整個體表可見明顯的紅色熒光。采用RT-PCR半定量分析比較出膜后72h的轉(zhuǎn)pTLA-DsRed和轉(zhuǎn)pTA-DsRed唐魚中RF

9、P mRNA的表達水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)pTLA-DsRed唐魚中RFP的表達量比轉(zhuǎn)pTA-DsRed唐魚的高35.7％。實驗顯示長度為3.0 kb的啟動調(diào)控序列具有更強的驅(qū)動外源基因在唐魚體內(nèi)表達的活性，推測唐魚β-actin 5'遠端啟動子序列中存在著轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控元件。 本實驗分離并證實了二種不同長度的唐魚β-actin基因啟動子在唐魚體內(nèi)均具有啟動外源基因轉(zhuǎn)錄的活性，且長度為3.0 kb的啟動調(diào)控序列具有更強的驅(qū)動活性。本實驗為