干擾素α對(duì)肝纖維化組織TGFβ1，F(xiàn)as抗原，TIMP1蛋白，Ⅳ型膠原及細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)及臨床研究.pdf

1、慢性病毒性肝病嚴(yán)重的病理轉(zhuǎn)歸為肝硬化，在臨床治療慢性乙型病毒性肝炎中如何阻止甚至逆轉(zhuǎn)肝硬化是治療病毒性肝炎的難點(diǎn)也是熱點(diǎn)。肝纖維化則是其前期病變，能否阻止抑或逆轉(zhuǎn)肝纖維化是治療各種慢性肝病的關(guān)鍵。 隨著臨床抗乙型病毒性肝炎的治療進(jìn)展，認(rèn)為IFNα不僅有抗病毒作用，IFNα也有抗肝纖維化作用。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)慢性乙型病毒性肝炎患者肝組織炎癥和纖維化程度，檢測(cè)TGFβ1、Fas抗原，細(xì)胞凋亡，肝纖維膠原定量，HBsAg及血清肝纖維化膠

2、原HA、LN、Ⅲ、Ⅳ含量，觀察Fas抗原、TGFβ1與細(xì)胞凋亡及膠原分布的關(guān)系；細(xì)胞凋亡與肝纖維化的關(guān)系；HBcAg分布與肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系；肝纖維化程度與血清纖維四項(xiàng)的關(guān)系。進(jìn)一步研究干擾素α治療前后肝組織Fas抗原及TGFβ1表達(dá)的分布、肝組織炎癥及纖維化與血清膠原定量的改變。從病理組織學(xué)角度觀察干擾素α臨床抗慢性病毒性肝炎肝纖維化的作用。 方法： 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分 1.1動(dòng)物來源：Wistar大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)

3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供健康清潔級(jí)大鼠，重180-220g，雄性，32只。 1.2動(dòng)物喂養(yǎng)：飼以玉米面為主桿狀飼料，自由飲水，實(shí)驗(yàn)前自由喂養(yǎng)1周，后隨機(jī)分為5組。皮下注射CCL4。第1次用0.5ml/100g體重，以后每隔3天皮下注射40％花生油劑CCL40.3ml/100g體重。注射CCL4確保在皮下，防止?jié)儼l(fā)生；注射CCL4要稱體重，按體重增減調(diào)整劑量。 1.3動(dòng)物分組.：A組(正常對(duì)照組)：2只。正常進(jìn)食、水，實(shí)驗(yàn)第一天皮

4、下注射400ml/L的花生油滴液5ml/kg，以后每隔3天皮下注射3ml/kg，同時(shí)肌肉注射生理鹽水0.01ml/kg，每隔3天，共6周。B組(模型對(duì)照組)：8只。正常進(jìn)食、水。實(shí)驗(yàn)第一天皮下注射400ml/L的CCL4花生油滴液5ml/kg，以后每隔3天皮下注射3ml/kg，同時(shí)肌肉注射生理鹽水0.01ml/kg，每隔3天，共6周。C組(IFN預(yù)防組)：8只。造模方法同B組，同時(shí)肌肉注射IFNα，1×106U/100g，每隔3天，共6

5、周。D組(IFN治療組)：8只。造模方法同B組，CCl4染毒時(shí)間12周，造模后第6周，肌肉注射IFNα，1×106U/100g，每隔3天，6周，共12周。E組：(生理鹽水對(duì)照組)6只。造模方法同D組，造模第6周肌肉注射生理鹽水0.01ml/kg，每隔3天，共12周。 1.4動(dòng)物處理：3周末斷頸處死B、C組大鼠各1只，6周末分別斷頸處死A組2只、B組大鼠7只、C組大鼠7只，12周末處死D組大鼠7只、E組大鼠5只。處死前稱體重，分離

6、血清，-20。C冰箱保存。剖腹取1cm×1cm×0.5cm肝右葉1塊用10％中性甲醛固定，常溫下保存，(勿放入冰箱內(nèi))。 1.5同期檢測(cè)ALT，同位素檢測(cè)大鼠血清透明質(zhì)酸(HA)，Ⅳ膠原。 2肝臟病理學(xué)檢查：肝組織病理經(jīng)10％甲醛固定24h,修切后自來水沖洗12h,從35％乙醇開始系列乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋后切成3um厚的薄片，37℃烘箱內(nèi)烘干。分別行HE染色觀察肝組織病理變化，觀察肝纖維化需做HE、Masso

7、n染色及VG染色。觀察肝組織炎癥活動(dòng)度(G)及肝纖維化程度(S)。 3免疫組織化學(xué)檢查：TGF-β1、Fas抗原，TIMP-1，Ⅳ型膠原。 4肝細(xì)胞凋亡原位檢測(cè) 采用TUNEL法，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。以不加未端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)作為陰性對(duì)照。光鏡下觀察，胞核染成棕黃色的為陽性細(xì)胞。 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所取數(shù)據(jù)以x±s表示，兩均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)和Ridit分析。用SAS統(tǒng)計(jì)

8、軟件操作。 結(jié)果： 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分 1.1大鼠一般狀況觀察 實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組大鼠A組體重保持穩(wěn)定，大鼠無一例死亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重增加76±9克。B、C、D、E組大鼠皮毛無光，食欲下降，體重減輕，D組死亡1例，E組死亡1例，共死亡2只。干擾素組與模型組體重在造模前與模型組無差異，造模后與對(duì)照組差異顯著,P＜0.05。 1.2大鼠肝臟大體形態(tài) 第3周CCl4組大鼠的肝臟明顯腫大，呈暗紅色。第6周肝

9、臟腫大，表面可見密集細(xì)小結(jié)節(jié)，質(zhì)地較韌。第12周大鼠表面形成為密集細(xì)小結(jié)節(jié)，質(zhì)地韌，邊緣鈍，第12周D組1例，E組2例形成腹水。 1.3肝組織病理學(xué)HE、Masson檢查 對(duì)照組A組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，第6-12周，模型組B、E組CCl4所致的大鼠肝纖維化組織中可見正常肝小葉結(jié)構(gòu)喪失，肝血竇擴(kuò)張充血，肝細(xì)胞顆粒變性明顯，小血管擴(kuò)張，肝內(nèi)血管結(jié)構(gòu)紊亂，大片灶狀肝細(xì)胞變性、壞死及空泡變，肝細(xì)胞氣球樣變性明顯，部分伴有脂肪變性。匯

10、管區(qū)纖維組織增生，匯管區(qū)及中央靜脈周圍大量粗大纖維間隔交聯(lián)，包繞形成假小葉，正常肝小葉結(jié)構(gòu)已被破壞。 CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，在造模的第3周，模型組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原組織增生，屬纖維化Ⅱ級(jí)，為肝纖維化期。第6周，模型組肝組織中纖維組織增生明顯，分割包繞肝小葉，有假小葉形成趨勢(shì)及假小葉形成，病理學(xué)肝纖維化分級(jí)多為Ⅲ-Ⅳ級(jí)，為肝硬化早期。第12周隨造模過程的持續(xù)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主要以粗大纖維分割為主和假小葉生成

11、，屬肝纖維化Ⅳ期，肝硬化晚期。Masson染色示匯管區(qū)大量膠原纖維增生，分割肝組織，形成典型假小葉，說明肝纖維化造模成功。 IFNα治療組肝小葉結(jié)構(gòu)尚存，肝竇腔內(nèi)瘀血明顯，有血栓形成。肝細(xì)胞有碎屑?jí)乃?，嗜酸小體多見。匯管區(qū)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。Masson染色見膠原纖維增生顯著，向小葉內(nèi)伸展，可見相互連接的纖維隔，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂。第6周，IFNα治療組肝纖維化程度均較單純CCL4造模B組肝纖維化程度為低((P＜0.05)，第12周，肝

12、組織模型及干擾素治療組均為肝硬化病理改變(P＞0.05)。 第3周，肝纖維化大鼠血清Ⅳ型膠原及HA明顯升高。第6周，模型組和干擾素干預(yù)組大鼠血清Ⅳ膠原水平與對(duì)照組相比均顯著升高(P＜0.05)，與模型組組比，干擾素預(yù)防組Ⅳ含量明顯降低(P＜0.05)。第12周，大鼠干擾素治療組血清Ⅳ較第6周血清Ⅳ水平無顯著差異(P＞0.05)。第12周模型組和干擾素干預(yù)組內(nèi)相比，干擾素干預(yù)組血清Ⅳ膠原較模型組顯著下降(P＜0.05)。

13、正常對(duì)照組未見肝組織細(xì)胞凋亡，第3周大鼠肝組織細(xì)胞凋亡顯著，第6周肝細(xì)胞凋亡均顯著，但干擾素與模型組間比較未見顯著差異(P＞0.05)，第12周細(xì)胞凋亡組內(nèi)未見差異，與第6周比較也未見顯著差異(P＞0.05)。 1.4免疫組化檢查 2.4.1TGFβ1及Fas抗原表達(dá)：免疫組化顯示正常肝組織不表達(dá)或僅微弱表達(dá)TGFβ1和Fas抗原，隨著肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展,TGFβ1和Fas抗原表達(dá)逐漸增多，模型組及干擾素預(yù)防組均較對(duì)照

14、組TGFβ1表達(dá)增強(qiáng)。第3周，模型組及干擾素預(yù)防組TGFβ1表達(dá)增強(qiáng)，第6周模型組B組較干擾素預(yù)防C組TGFβ1表達(dá)增強(qiáng)，且差異顯著(P＜0.05)。第12周，干擾素組較模型組表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)。 第3周，F(xiàn)as抗原在CC14誘導(dǎo)的肝纖維化的肝組織大量表達(dá)。第6周，干擾素干預(yù)組Fas抗原表達(dá)較模型組B組減輕(P＜0.05)，第12周干擾素組較模型組Fas抗原表達(dá)減輕，但無顯著差異。 2.4.2大鼠肝組織細(xì)胞凋

15、亡：正常對(duì)照組未見肝組織細(xì)胞凋亡，第3周大鼠肝組織細(xì)胞凋亡顯著，第6周細(xì)胞凋亡組內(nèi)未見差異，與第12周比較也未見顯著差異。 2.4.3大鼠肝組織TIMPl表達(dá)：實(shí)驗(yàn)組正常大鼠肝組織中僅見個(gè)別弱染色的TIMPl表達(dá)細(xì)胞，散在分布于某些血管壁周圍。CCl4組肝損傷期多數(shù)大鼠肝組織內(nèi)均檢出TIMPl，各組間陽性程度無顯著差異。 2.4.4Ⅳ膠原表達(dá)：第6周-12周，匯管區(qū)，棕黃色顆粒的沉積顯著增強(qiáng)，其陽性程度，干擾素干預(yù)的C組

16、較模型組B組顯著輕，P＜0.05,第12周模型組E組較第6周的模型B組Ⅳ膠原表達(dá)程度更加顯著(P＜0.05)，第12周干擾素治療組D組與第6周的干擾素預(yù)防組C組間表達(dá)程度無顯著差異，但第12周干擾素治療的D組Ⅳ膠原表達(dá)程度較E組顯著輕(P＜0.05)。 結(jié)論： 1臨床部分 ①慢性乙型病毒性肝炎患者，隨著肝纖維化程度增高，F(xiàn)as抗原、TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)；肝細(xì)胞凋亡明顯增多。②干擾素α可下調(diào)Fas、TGF-β1的表

17、達(dá)，顯著減少肝細(xì)胞凋亡。③干擾素α治療肝纖維化需要持續(xù)的療程，6-9個(gè)月才可見顯著療效，尤其治療9個(gè)月的療效更加顯著，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減輕，呈輕度纖維化表現(xiàn)。 2實(shí)驗(yàn)部分①大鼠在CCL4誘導(dǎo)下，肝纖維化造模成功；模型組大鼠肝纖維化在造模周期中，有典型的肝硬化形成過程；與模型組相比干擾素預(yù)防組肝纖維化程度降低，表明干擾素能明顯改善纖維化程度。②TGFβ1、Fas抗原、TIMPl、Ⅳ膠原與肝纖維化程度密切相關(guān)，其中Fas抗原的表達(dá)與