EAE時(shí)第四腦室外側(cè)隱窩的形態(tài)學(xué)研究.pdf

1、目的：對EAE不同時(shí)期的大鼠第四腦室外側(cè)隱窩形態(tài)學(xué)進(jìn)行動態(tài)觀察，探討該部位室管膜及室管膜下結(jié)構(gòu)的變化特點(diǎn)以及與功能的關(guān)系。
　　 材料與方法：選擇健康Wistar雌性大鼠64只，體重200g±20g，主動免疫，制備EAE模型。在免疫后，7天為潛伏期組，14天為臨床極期組和21天為恢復(fù)期組，健康Wistar雌性大鼠作為對照組。常規(guī)經(jīng)心灌注固定取腦的第四腦室外側(cè)隱窩，分別對該部位室管膜及室管膜下進(jìn)行光鏡結(jié)構(gòu)觀察（HE）；細(xì)胞凋亡的形

2、態(tài)學(xué)觀察；掃描電鏡以及透射電鏡觀察。
　　 1、EAE模型制備：動物腹腔內(nèi)注射6％水合氯醛（0.5ml/100g體重）麻醉后，碘酒、酒精局部消毒，用豚鼠脊髓勻漿加完全福氏佐劑（GPSCH-CFA）制成的乳劑，每只腳墊皮內(nèi)注射GPSCH-CFA乳劑0.1ml，共計(jì)0.4ml。
　　 2、光鏡標(biāo)本制備：動物腹腔內(nèi)注射6％水合氯醛（0.5ml/100g體重）麻醉，打開胸腔，經(jīng)心升主動脈快速灌注37℃生理鹽水，同時(shí)剪開右心耳，生

3、理鹽水灌注量100ml。從右心耳流出的液體變淡后，迅速換成4％多聚甲醛磷酸緩沖液（0.1M，pH7.2）進(jìn)行快速灌注，動物出現(xiàn)抽搐僵直的現(xiàn)象為最佳效果，快速灌注200ml后再慢速灌注此液200ml，整個(gè)過程需40分鐘。灌注完畢取出整腦，去除腦橋以上部分和延髓以下的部分，取中間腦組織塊在上述固定劑中（4℃）后固定24小時(shí)，然后在磷酸緩沖液（0.1M，pH7.2）中沖洗三次，每次6小時(shí)，再用梯度酒精脫水，入二甲苯中透明，浸蠟，包埋，修塊，石

4、蠟連續(xù)切片，載片撈片，60℃烤箱過夜。然后依次入二甲苯脫蠟，梯度酒精置換，蘇木精染色及伊紅復(fù)染。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。室溫風(fēng)干后，顯微鏡觀片，OLYMPUS萬能顯微鏡照相。
　　 3、TUNEL樣品制備：動物的麻醉、灌注、取材和后固定、石蠟切片過程同光鏡標(biāo)本制備，切片厚5μm，標(biāo)記過程如下：梯度酒精置換入水后，蛋白酶K消化（20μg/ml）30分鐘，0.3％H2O2甲醇液室溫孵育30分鐘，冰上孵育2分鐘后，加上

5、TUNEL反應(yīng)液50ul，在濕盒中37℃下孵育1小時(shí)，加入50ul轉(zhuǎn)化劑-POD，在濕盒中37℃下孵育30分鐘，加入底物DAB溶液，室溫下孵育10分鐘。標(biāo)記過程中，每步間用PBS沖洗。脫水、透明，蘇木素復(fù)染，封片。室溫風(fēng)干后，顯微鏡觀片，OLYMPUS萬能顯微鏡照相。
　　 4、掃描電鏡樣品制備：麻醉、灌注方法同光鏡標(biāo)本制備，但灌注液為4％的多聚甲醛和2.5％戊二醛磷酸緩沖液（0.1M，pH7.2）（多聚甲醛磷酸緩沖液灌注前一天

6、配出，4℃保存；戊二醛在灌注之前再加入多聚甲醛溶液）。灌注完畢取整腦，然后經(jīng)正中線切開整腦，將腦分為左右兩塊在上述固定劑中（4℃）后固定12小時(shí)。取一側(cè)腦塊從背側(cè)移去小腦，暴露第四腦室底和外側(cè)隱窩，沿著中腦上端，延髓下端冠狀方向?qū)⒍嘤嗟哪X組織去除，之后將腦組織塊放入磷酸緩沖液（0.1M，pH7.2）中過夜后，再用上述磷酸緩沖液沖洗切塊三遍，然后梯度酒精脫水，叔丁醇置換，二氧化碳臨界點(diǎn)干燥，真空噴金，日立S-3500N觀察、照像。

7、　　 5、透射電鏡樣品制備：取材過程同掃描電鏡樣品制備，在灌注固定后，經(jīng)正中線切開整腦，從背側(cè)去除小腦，暴露出第四腦室底，切取外側(cè)隱窩入口處腦塊3×3×2mm，然后投入1％鋨酸固定液作后固定，磷酸緩沖液沖洗三次，梯度酒精脫水，Epon812包埋，LKB-V型超薄切片機(jī)切片，H-600型透射電鏡觀察照相。
　　 結(jié)果：
　　 1、光鏡觀察結(jié)果：正常對照組室管膜細(xì)胞排列稀疏；EAE大鼠潛伏期（7天）組室管膜細(xì)胞排列密集，室

8、管膜下組織疏松，血管豐富、擴(kuò)張；發(fā)病極期（14天）組室管膜細(xì)胞排列更加密集，室管膜下組織極度水腫，室管膜層與其下層有部分分離，血管周圍及室管膜下有大量的炎性細(xì)胞浸潤；恢復(fù)期（21天）組室管膜細(xì)胞排列密集，室管膜下組織疏松，血管擴(kuò)張。
　　 2、TUNEL組化細(xì)胞凋亡的觀察結(jié)果：光鏡下凋亡細(xì)胞的形態(tài)呈棕黃色或棕褐色著色，典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?yōu)榧?xì)胞變小變圓，核固縮。正常對照組偶見凋亡細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組EAE潛伏期室管膜細(xì)胞出現(xiàn)凋亡細(xì)胞

9、、發(fā)病極期室管膜及室管膜下血管周圍凋亡細(xì)胞密集，恢復(fù)期凋亡細(xì)胞數(shù)量遞減。凋亡細(xì)胞排列的密集程度，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，EAE實(shí)驗(yàn)組與正常對照組比較差異均有顯著性（P<0.01）；14天組與7天組和21天組比較有顯著性差異；7天組與21天組無差異。
　　 3、掃描電鏡觀察結(jié)果：本研究在電鏡下觀察到EAE大鼠第四腦室外側(cè)隱窩室管膜細(xì)胞有分泌現(xiàn)象，分泌顆粒呈囊泡球形，表面光滑，多成堆集中分布，出口處發(fā)現(xiàn)有大量的巨噬樣細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞。

10、　　 結(jié)論：
　　 1、第四腦室外側(cè)隱窩室管膜及室管膜下，凋亡細(xì)胞在EAE組較正常對照組明顯增多，發(fā)病極期凋亡細(xì)胞達(dá)最多，凋亡細(xì)胞隨EAE時(shí)程呈單峰變化趨勢，且較相臨部位明顯增多。
　　 2、光鏡觀察，第四腦室外側(cè)隱窩室管膜及室管膜下在不同的時(shí)程有顯著的變化，室管膜細(xì)胞可增多，室管膜下組織水腫，血管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤。各期變化程度依次是發(fā)病極期>恢復(fù)期>潛伏期。
　　 3、在EAE大鼠應(yīng)用掃描電鏡和透射電鏡觀察